[发明专利]一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法

说明书

本发明涉及一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法，本发明制备的无毒性破伤风梭菌亚单位疫苗，系采用经过密码子优化的破伤风毒素C片段的重组毒素(rTTc)生产，即最大限度地保证疫苗的安全性，又保持其有效性。同时，还疫苗的抗原能够以可溶的形式表达，因此具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行破伤风梭菌疫苗升级换代的理想候选疫苗。

技术领域

本发明涉及一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗及其生产方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

破伤风梭菌(Clostridum tetani)是一种能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健 康和畜禽养殖业危害极大，该菌的致病因素是菌体分泌的外毒素，破伤风毒素(Tetanus toxin，TT)。 目前，使用的商品化破伤风梭菌疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗在预防动物破伤风梭菌所致疾病方 面虽然取得了一定的效果，但该类疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动 物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物 安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接 种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、 免疫原性强的破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，是未来的发展方向。

已有研究证实，破伤风毒素(TT)，全长1 315个氨基酸，相对分子质量约150 000，由A、B 和C 3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)是重链的C末端， 相对分子质量50 000，是毒素与细胞受体的结合区域。已经有的研究发现，该区域在原核表达系统 中可溶表达的比例较高，具有较好的免疫原性(Wells J M,Wilson PW,Norton P M,et al.Lactococcus lactis:high-level expression of tetanus toxinfragment C and protection against lethal challenge[J]. MolecularMicrobiology,2010,8(6):1155-1162.)。

发明内容

本发明目的在于利用构建的重组表达破伤风毒素C片段(Tetanus toxin Cfragment，TTc)的大 肠杆菌制备出一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，用于预防由破伤风梭菌感染引起的疾病。

本发明技术方案

1.一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌作为 宿主细胞并在细胞质中表达的重组破伤风毒素C片段(rTTc)；该重组毒素是由重组表达rTTc的 大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希 氏菌BL/MBo株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17320；

所述疫苗用于预防由破伤风梭菌感染所致疾病。

2.本发明所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有的rTTc 与成熟的野生型破伤风毒素(TT)相比，只含有无毒区域C片段(简称TTc)；

所述rTTc无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

3.本发明所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗中含有的 rTTc的编码基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。

4.本发明所述一种无毒性破伤风梭菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有的rTTc 末端含有便于蛋白纯化的标签，优选为C端含有6个组氨酸(6*His)标签。