[发明专利]一种酶促催化EGCG甲基化的方法在审
| 申请号： | 201910353717.7 | 申请日： | 2019-04-28 |
| 公开（公告）号： | CN110106213A | 公开（公告）日： | 2019-08-09 |
| 发明（设计）人： | 杨鑫;安泰;朱威宇;陈博;陈志雄;涂丛慧;卢秋华;焦琳;郑晓卫;金渭武 | 申请（专利权）人： | 中粮营养健康研究院有限公司;清华海峡研究院（厦门）;厦门茶叶进出口有限公司 |
| 主分类号： | C12P17/06 | 分类号： | C12P17/06;C12N9/10;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京信慧永光知识产权代理有限责任公司 11290 | 代理人： | 董世豪;张淑珍 |
| 地址： | 102209 北京市*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 甲基化 酶促催化 甲基转移酶基因 重组大肠杆菌 催化反应 粗酶液 培养物 酶促 整合 制备 茶叶 | ||
1.一种酶促催化EGCG甲基化的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)对整合有来自Benifuuki茶叶的O-甲基转移酶基因的重组大肠杆菌进行培养，得到重组大肠杆菌培养物；
(2)将所述重组大肠杆菌培养物进行离心，收集菌体，随后向所述菌体中加入PBS缓冲液进行重悬，超声破碎，离心收集上清液，从而得到含有O-甲基转移酶的粗酶液；
(3)向EGCG的水溶液中添加所述粗酶液、S-腺苷基甲硫氨酸和MgCl2，酶促催化0.5-2h，其中，相对于EGCG的水溶液的体积而言，加入40％v/v-60％v/v的所述粗酶液、终浓度为150μmol/L-170μmol/L的所述S-腺苷基甲硫氨酸和终浓度为190μmol/L-210μmol/L的所述MgCl2。
2.如权利要求1所述的方法，在所述步骤(1)中，将所述重组大肠杆菌在具有如下组成的发酵培养基中进行培养：葡萄糖20g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.2g/L，以及余量的水。
3.如权利要求1或2所述的方法，在所述步骤(1)中，将所述重组大肠杆菌在所述发酵培养基中培养至OD600为55-65、优选60时，向所述发酵培养基中流加浓度为10％(w/v)的乳糖。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，在所述步骤(1)中，将所述重组大肠杆菌在所述发酵培养基中在30℃下进行培养。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，在所述步骤(1)中，将所述重组大肠杆菌在所述发酵培养基中进行培养，直至培养物的OD600达到120-140、优选120-130。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，在所述步骤(2)中，对所述重组大肠杆菌培养物在12000rpm离心10min。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，在所述步骤(2)中，向所述菌体中加入等体积的20mM PBS缓冲液。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，在所述步骤(2)中，以12000rpm离心10min收集所述上清液。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，在所述步骤(3)中，加入50％v/v的所述粗酶液。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，在所述步骤(3)中，加入终浓度为160μmol/L的所述S-腺苷基甲硫氨酸；
另外优选地，在所述步骤(3)中，加入终浓度为200μmol/L的所述MgCl2。
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