[发明专利]一种酶促催化EGCG甲基化的方法

说明书

本发明涉及一种酶促催化EGCG甲基化的方法，其中，通过从整合有来自Benifuuki茶叶的O‑甲基转移酶基因的重组大肠杆菌的培养物中制备粗酶液，并且在特定条件下进行酶促催化反应，从而实现了将EGCG高效地甲基化的效果。

技术领域

本发明涉及提高酶促催化效率的方法，具体而言，涉及一种高效率地酶促催化EGCG甲基化的方法。

背景技术

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中主要的多酚类物质，其中，酯型儿茶素是茶叶苦涩味特性的主体成分，EGCG的突出的抗氧化性能引起了国内外的广泛关注。加拿大麦克马斯特大学临床前证据表明EGCG能够干扰有毒低聚物的形成，该有毒低聚物是导致阿兹海默症患者认知能力衰退的早期嫌疑之一。但是，EGCG在室温下不稳定，且很难输送到人体中，尤其是大脑，因此修饰EGCG，使其更加有效地用于食品添加剂。甲基化儿茶素(EGCG3”Me和EGCG4”Me)具有较好的抗过敏功效，口服甲基化儿茶素(5-50mg/kg)可有效抑制I型过敏，且与浓度呈正相关。甲基化儿茶素在抑制组胺释放方面较非甲基化儿茶素具有更高的效力，且血液对其具有高吸收率，对ACE(血管紧张素转移酶)活性和MLC(肌球蛋白轻链)磷酸二酯酶具有很高的抑制作用。大量研究证实，儿茶素具有抑菌、抗病毒等多种生物学功能，儿茶素对100多种致病菌(如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎支原体、肉毒梭状芽孢杆菌)有明显的抑菌活性，有效抑菌浓度多数为10-50μg/mL。

因此，采用O-甲基转移酶通过酶催化方法专一性地将茶叶中的EGCG甲基化，在研发具有抗过敏等功能的天然药物和功能性食品添加剂具有加大的应用前景。酶催化过程具有反应条件温和，且反应过程中无有机溶剂等优点。然而，催化效率受众多因素的影响，现有的酶催化效率较低，难以满足实际生产的需要。

因此，有必要开发出具有高的催化效率的酶促催化EGCG甲基化的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶促催化EGCG甲基化的方法，从而实现了将EGCG更高效地甲基化。

其中，本发明涉及的酶促催化EGCG甲基化的方法包括如下步骤：

(1)对整合有来自Benifuuki茶叶的O-甲基转移酶基因的重组大肠杆菌进行培养，得到重组大肠杆菌培养物；

(2)将所述重组大肠杆菌培养物进行离心，收集菌体，随后向所述菌体中加入PBS缓冲液进行重悬，超声破碎，离心收集上清液，从而得到含有O-甲基转移酶的粗酶液；

(3)向EGCG的水溶液中添加所述粗酶液、S-腺苷基甲硫氨酸和MgCl₂，酶促催化0.5-2h，其中，相对于EGCG的水溶液的体积而言，加入40％v/v-60％v/v的所述粗酶液、终浓度为150μmol/L-170μmol/L的所述S-腺苷基甲硫氨酸和终浓度为190μmol/L-210μmol/L的所述MgCl₂。

本发明通过采用整合有特定来源的O-甲基转移酶基因的重组大肠杆菌来制备含有O-甲基转移酶的粗酶液，并采用该粗酶液在特定条件下进行酶促催化反应，从而实现了将EGCG高效地甲基化的效果。

具体实施方式

EGCG(下述式I所示的化合物)作为来自绿茶的儿茶素中的主要组分，表现出了良好的抗氧化性。能够专一性地将EGCG进行甲基化的酶，是以该化合物作为底物通过酶催化方法而将其进行甲基化的酶，例如，本发明中提及的O-甲基转移酶。