[发明专利]黄牛PLAG1基因CNV分子标记的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种黄牛PLAG1基因CNV分子标记辅助检测生长性状的方法及其应用：以黄牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增PLAG1基因拷贝数变异区域和内参基因BTF3的部分片段，根据2^‑ΔΔCt方法将定量结果分为多拷贝型和正常型，从而鉴定黄牛个体PLAG1基因的拷贝数变异类型。本发明在DNA水平上检测与黄牛生长性状密切相关的拷贝数变异，该拷贝数变异可作为中国黄牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，用于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作。

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于实时荧光定量PCR(qPCR) 技术检测黄牛PLAG1基因CNV标记的方法。该方法以基因组DNA为模板，利用实时定量PCR，以BTF3基因为参照，根据-ΔΔCt值确定个体的拷贝数变异类型。

背景技术

随着基因组学和生物信息学的不断发展，肉牛育种的方向由表型选育向分子育种发展。分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该育种技术是借助 DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)与简单重复序列(Simple sequencerepeat, SSR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)均为基因组结构变异 (srtuctural variation,SV)类型，在物种表型变异、物种演化等方面起着重要作用。拷贝数变异主要指1kb～5Mb的DNA片段拷贝数改变，这些片段的缺失、重复、倒位和异位统称为CNV。CNV是一种亚显微水平结构变异类型，包括拷贝数增加(Copy number gain) 和拷贝数减少(Copy number loss)。随着新一代测序技术和相应运算程序的结合发展，越来越小的具有拷贝数变异性质的DNA片段被识别，CNV的定义也不断发生改变。

染色体结构的改变主要表现为同源重组(homologous recombination,HR)和非等位同源重组(Non-allelic homologous recombination,NAHR)两种机制。NAHR是产生CNV的重要机制，主要发生在减数分裂时期的DNA损伤修复过程中，往往位于同源重复区(Segmental duplication,SD)或低拷贝的重复区内(Low copy repeats,LCRs)。同源序列的倒位、重复或缺失都会造成特定基因拷贝数的改变进而导致染色体结构的改变。此外，基于DNA损伤及错误重复修复的非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)、重复叉停滞及模板交换(Fork stalling and template switching,FoSTeS)和微同源序列介导重复(Microhomol-ogy-mediated replication-dependent recombination,MMBIR)也是产生 CNV的重要途径。NHEJ与NAHR的形成特征不同，它是在两个重组末端之间不具有高同源序列的基础上仍然能够发生DNA断端连接，导致染色体重排的发生。

众多的研究表明，生长因子在调节机体生长发育的过程当中起着至关重要的作用，而多形性腺瘤基因(pleomorphic adenoma gene,PLAG)就起着这样的作用。作为PLAG家族的重要成员之一，PLAG1基因编码500个氨基酸的锌指蛋白，位于人的8号染色体，cDNA 全长为7317bp，包含5个外显子，编码框长度为1503bp，从第4外显子的最后端和第5 外显子的起始端开始编码。PLAG1基因是最常见的存在于唾液腺的多形性腺瘤中的突变基因，它的作用与抑制基因p53相似，可调节细胞周期和细胞凋亡。然而，PLAG家族特别是PLAG1基因在牛的生长发育过程中的详细机制尚未研究清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄牛PLAG1基因CNV分子标记辅助检测生长性状的方法及其应用。