[发明专利]一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法

说明书

本发明公开了一种生产β‑丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法，属于代谢工程领域。本发明构建得到的菌株B0016‑083BB/pPL‑panD、B0016‑100BB/pPL‑panD、B0016‑110BB/pPL‑panD厌氧发酵生产β‑丙氨酸的产量分别为57.55×10^‑3g/L、58.37×10^‑3g/L、80.31×10^‑3g/L，较出发菌株B0016‑080BB/pPL‑panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。本发明首次利用厌氧发酵生产β‑丙氨酸，与好氧发酵相比，理论转化率更高，副产物更少，且避免了好氧发酵中所需通气搅拌，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

β-丙氨酸即3-氨基丙酸，是自然界中存在的唯一一种β型氨基酸。近年来，在医药、化工、食品、环境等领域的作用日渐突出。有报道称β-丙氨酸是未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。目前，β-丙氨酸的市场需求巨大，但是工业生产β-丙氨酸主要采用化学合成法，存在着环境污染严重、副产物多、纯化困难、工艺条件苛刻等问题。寻求绿色的生产方法具有十分明显的经济和社会效益。生物合成法通常指利用拥有特定代谢途径的微生物转化底物生成β-丙氨酸的方法，生物合成法有绿色无污染、生产条件温和、对设备要求简单等优点，因此越来越受到青睐。

能够发酵积累β-丙氨酸的微生物菌株有很多，目前用于研究的菌株主要集中在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。但谷氨酸棒杆菌发酵生产β-丙氨酸副产物谷氨酸浓度较高，后续需要复杂的分离和纯化过程，增加生产成本。大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，即可以在好氧条件下进行快速生长，又可以在厌氧条件下进行混合酸发酵。作为一种模式生物，大肠杆菌遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究β-丙氨酸发酵途径和提高β-丙氨酸产量的理想载体。

大肠杆菌可以利用甘油为底物经过一系列酶促反应合成富马酸，富马酸在天冬氨酸氨裂解酶(由aspA基因编码)的催化下合成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸在天冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因编码)的催化下合成β-丙氨酸。

现有报导的大肠杆菌发酵生产β-丙氨酸均为好氧发酵，但是好氧发酵生产β-丙氨酸副产物多而复杂，导致转化率低，且好氧通气搅拌成本较高。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产β-丙氨酸的重组菌，所述重组菌同时整合表达和游离表达了天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD；所述整合表达，包括将前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD整合到大肠杆菌出发菌株的染色体上；所述游离表达，包括将天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD连接到质粒pPL451上获得重组质粒pPL-panD，然后将重组质粒pPL-panD转入大肠杆菌出发菌中。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌出发菌株是敲除野生型菌株E.coli CICIMB0016中的乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldhA得到重组菌株E.coli B0016-050，然后在E.coli B0016-050中敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、panC和ptsG而获得的菌株，将其命名为B0016-080BB。

在一种实施方式中，所述天冬氨酸-α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD的融合基因片段为ci857-p_R-p_L-panD-kan，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。