[发明专利]小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法

权利要求书

1.小麦-冰草易位系中发掘外源功能候选基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、冰草的全长转录组测序：获取冰草Z559根、茎、叶、幼穗、籽粒多个组织，分别提取各个组织mRNA且等量混合，构建PacBio测序文库，利用PacBio sequel平台的2个cell对混合样品进行全长转录组测序；

S2、小麦受体Fukuhokumugi和易位系的转录组测序：分别获取Fukuhokumugi和易位系植株的根、茎、叶、籽粒多个组织，然后提取各个组织mRNA且等量混合，对Fukuhokumugi和易位系各自的混合样品构建高通量测序文库，并使用Illumina HiSeq2500高通量测序平台进行转录组测序；

S3、易位系中冰草外源染色体易位片段中特异表达的转录本分析：整合冰草全长转录组测序数据和小麦参考基因组序列作为总的参考序列，用STAR软件将Fukuhokumugi和易位系的转录本序列与所述总的参考序列进行比对，仅保留唯一比对的序列比对结果，然后用featureCounts软件分别计算Fukuhokumugi和易位系中比对到每个转录本上的序列数目，最后使用DESeq2软件进行Fukuhokumugi和易位系之间转录本的序列差异表达显著性检验，用log2(差异倍数)≤-4且假阳性率0.05进行过滤，获得易位系中外源染色体片段中特异表达的转录本，作为候选转录本序列；

S4、分子标记开发：将获得的候选转录本序列与小麦参考基因序列进行比对，并根据比对结果找出候选转录本与小麦A/B/D基因组上同源基因之间的差异，根据差异序列设计EST标记及其检测引物；利用设计的EST标记在冰草Z559、Fukuhokumugi和易位系中进行PCR验证，从而验证外源染色体片段中特异表达的转录本的真实性；

S5、候选基因预测：对于步骤S4中获得的真实候选转录本序列，与小麦参考基因序列进行比对，进行比较基因组学分析，构建易位系中外源染色体片段与小麦A/B/D基因组间的比较基因组学图谱；对共线性候选区间内的基因进行功能注释，获得外源功能候选基因；

所述小麦-冰草易位系为普冰3035。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1还包括对冰草全长转录组测序数据进行过滤、质控；具体方法为：使用IsoSeq3软件处理原始测序数据，首先，使用ccs算法进行分类，产生每个零模式波导孔中的共有序列，保留具有至少一个完整通道的序列用于后续分析；其次，使用Lima算法获得全长序列；最后，进行聚类和矫正获得高质量的冰草全长转录本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括对原始测序数据进行质控、去污染和接头，得到高质量的测序数据；具体方法为：去除两端测序质量值小于20的碱基，小于25bp的测序读长将被去除，过滤使用Trimmomatic软件执行。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述EST标记包括WGRG8和WGRG9，它们的检测引物分别如下：

WGRG8_F:5′-TGCCAGTGGTGACCAATGCA-3′；

WGRG8_R:5′-ACTTGGGGAAGAGTCTCACT-3′；

WGRG9_F:5′-TCCAAATCCTCCAGCAAATC-3′；

WGRG9_R:5′-CCCGAGACCGAGCACTATAC-3′。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤S5获得的外源功能候选基因包括与小麦千粒重相关的候选基因transcript/2、transcript/4，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。