[发明专利]小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法

说明书

本发明提供小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法，该方法仅需对小麦远缘杂交衍生的小片段易位系及其小麦受体和野生近缘种供体三个样品进行转录组测序，结合生物信息学分析、比较基因组学和功能标记开发验证，可实现从小麦远缘杂交衍生系中快速挖掘外源功能候选基因。本发明不依赖小麦近缘植物的参考基因组序列，实现了低成本且高效地筛选功能候选基因，为功能基因的克隆奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因组学、转录组学及生物信息学领域，具体地说，涉及小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法。

背景技术

从小麦进化历史和育种进程可以看出，远缘杂交是拓宽小麦遗传基础，创制新种质，实现小麦高产、稳产育种的有效途径之一。国内外学者已经实现了小麦族的所有属与小麦间的杂交，获得了大量的且具有可利用价值的小麦新种质，从这些新种质中发掘新的功能基因并加以利用，将在小麦抗性育种中发挥着举足轻重的作用。由于多数小麦近缘植物没有参考基因组序列，且在小麦背景下，对外源功能基因进行图位克隆的研究相对困难。有研究人员通过突变体筛选、抗病基因富集测序和易位染色体分拣测序组装等技术，成功从簇毛麦的6V染色体上克隆了抗白粉病基因Pm21。类似研究工作耗时长、工作量大、成本高，且相关的研究主要集中在抗病相关的基因，但与小麦复杂的数量性状相关的基因克隆还没有相关的研究报道。因此，如何有效地在小麦背景下快速筛选外源功能基因，特别是与产量等复杂性状相关的基因，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法，包括以下步骤：

A、小麦近缘植物的全长转录组测序：获取小麦近缘植物多个组织且包含所研究的目的性状发生前和发生时的组织，分别提取各个组织mRNA且等量混合；为了获得小麦近缘植物的全长转录组参考序列，利用第三代测序技术和平台对混合样品进行全长转录组的建库和测序。

B、小麦远缘杂交后代小片段易位系和小麦受体的转录组测序：分别获取小麦远缘杂交后代小片段易位系和小麦受体植株多个组织且包含所研究的目的性状发生前和发生时的组织，分别提取各个组织mRNA且等量混合；为了对转录本的表达进行定量，利用第二代测序技术和平台对各自的混合样品进行高通量转录组的建库和测序，分别得到小麦受体的转录本序列和易位系的转录本测序数据。

C、易位系中外源染色体片段中特异表达转录本分析：对小麦近缘植物的全长转录组测序数据进行生物信息学分析(生物信息学分析包括：使用IsoSeq3软件处理原始测序数据。具体步骤如下：首先，使用ccs算法进行分类，产生每个零模式波导孔中的共有序列，保留具有至少一个完整通道的序列用于后续分析；其次，使用Lima算法获得全长序列；最后，进行聚类和矫正)，获得非嵌合且全长的转录本序列，去除冗余后，与小麦参考基因组序列和注释文件进行整合作为总的参考序列；将小麦受体的转录本序列以及易位系的转录本序列分别与所述总的参考序列进行比对，并过滤，去重复，仅保留唯一比对的序列比对结果，然后统计比对到每个转录本上的序列数目，最后进行小麦受体和易位系之间转录本的序列差异表达显著性检验，根据易位系和小麦受体之间转录本的序列比对数目，使用参数log2(差异倍数)≤-4和假阳性率0.05进行过滤(为了获得可信的以及统计上显著差异表达的转录本，必须控制表达的差异倍数以及多重检验的P-value)，获得易位系中外源染色体片段中特异表达的转录本，作为候选转录本序列。

D、分子标记开发：将获得的候选转录本序列与小麦参考基因序列进行比对，根据比对结果找出候选转录本与小麦基因组上同源基因之间的差异，根据差异序列设计并开发分子标记及其检测引物；利用设计的引物在小麦近缘植物、小麦受体和易位系中进行PCR验证，确定所获得的外源染色体片段中特异表达的转录本的真实性。