[发明专利]一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用

权利要求书

1.一种荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含有R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因的重组质粒；

(2)将步骤(1)构建得到的重组质粒转入能提供π蛋白的宿主菌中得到重组菌株，所述的重组质粒能在所述的宿主菌进行复制；

(3)将所述的重组菌株与E.coli C600混合后进行培养，得到孵育物；

(4)将步骤(3)所述的孵育物涂布在含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基中培养，然后对所述的LB琼脂培养基上的菌落的荧光情况进行观察，呈现荧光的菌株即为所述的荧光菌株E.coli C600。

2.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的Lux基因簇为LuxC-LuxD-LuxA-LuxB-LuxE基因片段；

步骤(1)中所述的亚碲酸盐耐药基因即为tpm耐药基因；

步骤(1)中所述的以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐耐药基因形成的转座单元为ISApl1-tpm耐药基因-LuxCDABE-ISApl1；

步骤(1)中所述的R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因在重组质粒中的连接顺序为ISApl1-tpm耐药基因-LuxCDABE-ISApl1-R6k复制子-RP4接合转移基因；

步骤(1)中所述的R6k复制子为自杀型R6k复制子；

所述的自杀型R6k复制子的核苷酸序列为如GenBank登陆号为MH626522.1.的序列自5’末端第504至892位核苷酸所示；

所述的Lux基因簇的核苷酸序列为如GenBank登陆号为KX670548.1.的序列自5’末端第3429至9187位核苷酸所示；

ISApl1插入序列的核苷酸序列为如GenBank登陆号为MH924589.1.的序列自5’末端第219,280至220,203位核苷酸所示；

亚碲酸盐耐药基因的核苷酸序列为如GenBank登陆号为KX397287.1.的序列自5’末端第4,473至5,126位核苷酸所示；

RP4接合转移基因的核苷酸序列为如GenBank登陆号为AJ868289.1.的序列自5’末端第147至1,876位核苷酸所示。

3.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：

步骤(1)的重组质粒的具体构建方法为：

①将pUC19-tpm质粒通过Afl II和Xho I双酶切，得到片段大小为3380bp酶切产物I；将pUC19-RP4质粒通过Afl II和Xho I双酶切，得到片段大小为4603bp酶切产物II；然后连接酶切产物I和酶切产物II，得到pTFX-RP4质粒；

②将步骤①中得到的pTFX-RP4质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，得到片段大小为5897bp酶切产物III；将pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，得到片段大小为7332bp酶切产物IV；然后连接酶切产物III和酶切产物IV，得到所述的重组质粒。

4.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的能提供π蛋白的宿主菌为营养缺陷型细菌；

步骤(3)中所述的培养为静置培养；

步骤(4)中所述的含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基中的亚碲酸钠浓度为25μg/mL；

步骤(4)中所述的培养为培养至能够观察到直径2mm单菌落。