[发明专利]一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用。通过构建含有R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因的重组质粒，将所述重组质粒转入其能够复制的宿主菌中得到重组菌株，再将所述的重组菌株与E.coli C600混合培养，即可筛选得到所述的荧光菌株E.coli C600。所述的荧光E.coli C600获得外援DNA的能力不受影响，稳定性强，能够稳定遗传，荧光不会随着细菌传代而丢失，可作为接合实验的受体菌。所述的荧光E.coli C600在质粒接合转移相关领域中能够更高效、直观地鉴别受体菌和接合子，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及荧光标记技术，特别涉及一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用。

背景技术

质粒是一种小的环状双链DNA分子，可以独立地复制。它不但可以在细菌之间传播，也可以在别的生物之间传播，例如古生菌和真菌。质粒上携带的基因通常给予宿主生物特殊的能力，如：抗生素耐药性、重金属耐药性或病菌因素。质粒经常可以自然地传播到别的细菌中。即使在不同的种属之间也可以传播，这使得它们能够轻易地高速传播。通过接合实验研究临床质粒的接合性和移动性，进而研究相关基因的传播机制以及机制基因传播的化合物是分子生物学中常用的方法。如GEtino等通过利用接合的方法筛选抑制质粒传播的化合物(GEtino and Cruz)；如邱等发现纳米材料可以提高质粒传播的效率(Qiu Et al.,2015)；又如孙艺璇等通过接合实验研究压抑菌浓度抗生素对质粒传播的影响(孙艺璇Etal.,2016)。质粒传播给不同细菌的效率不同，为了高效获得临床接合子，就必须需要一株能够高效率获得外源DNA的细菌作为受体菌。

E.coli C600不能分解利用乳糖，因此在麦康凯琼脂上长出的菌落为白色，且其耐链霉素；而大多数大肠杆菌能够利用乳糖代谢，在麦康凯上长红色。此外，由于其是一株天然感受态细胞，和其他F⁺供体菌细菌经菌毛连接后，可高效获得供体菌的质粒，被广泛应用于接合实验相关研究。

但另一部分大肠杆菌与所有沙门氏菌等细菌，由于无法利用乳糖，因此在麦康凯琼脂上仍长出白色菌落，这为筛选获得外源质粒的E.coli C600(接合子)带来了一定的困难，而现有的鉴定接合子与供体菌的主要方法是通过细菌基因组重复序列PCR(ERIC PCR)的方法鉴定接合子和供体菌。ERIC PCR耗时耗力，且需要大量工作。如果供体菌和接合子的ERIC PCR产物的电泳谱型一致，则通过ERIC PCR的方法也无法有效确定为接合。此外，有的受体菌不可以在麦康凯琼脂培养基上生长，则无法采用麦康凯选择培养基筛选接合子，这严重影响接合子筛选的精确性和准确性，增加了科研工作量。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荧光菌株E.coliC600的构建方法。

本发明的另一目的在于提供通过所述的构建方法得到的荧光菌株E.coli C600。

本发明的另一目的在于提供通过所述的构建方法或通过所述的构建方法得到的荧光菌株E.coli C600的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种荧光菌株E.coli C600的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建含有R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐(tpm)耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因的重组质粒；

(2)将步骤(1)构建得到的重组质粒转入能提供π蛋白的宿主菌中得到重组菌株，所述的重组质粒可在所述的宿主菌进行复制；

(3)将所述的重组菌株与E.coli C600混合后再进行培养，得到孵育物；