[发明专利]Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用

说明书

本发明提供了Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用。所述的Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺采用了M₉培养基作为发酵培养基，通过IPTG或乳糖诱导发酵，各个环节有机配合实现了Peptibody多表位疫苗的规模生产。其中，所述的乳糖诱导发酵生产工艺能够实现高效稳定的诱导表达，进一步提高湿重和目的蛋白的产量；并可将接种量从2％提高至8％，有效缩短整个发酵时间。本发明成功实现了Peptibody工程菌的高密度发酵和Peptibody多表位疫苗的高效表达，简单稳定、易于放大，100L罐单次发酵生产目的蛋白的产量可达105.64g，具有良好的应用前景和工业生产价值。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，特别涉及Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用。

背景技术

肿瘤组织的发展与正常组织一样需要血管提供氧气和营养物质，而肿瘤血管需要在bFGF和VEGF等细胞因子的共同作用下才能生成，因此，bFGF和VEGF已经成为有效抑制肿瘤血管新生和肿瘤细胞发展的分子靶点。发明人团队利用生物信息学和噬菌体展示等技术筛选得到三个bFGF和三个VEGF抗原表位，为提高药物学特性与人的IgG1 Fc片段基因融合，构建pET28a重组质粒，通过大肠杆菌BL21表达目的蛋白，即Peptibody多表位疫苗。

在前期研究中，申请人也对重组菌株进行了诱导表达，但要实现Peptibody多表位疫苗从研究到生产的进一步突破，目前至少还需创新解决如下问题：

(1)在实验室研究阶段中的生产规模是在1L以内的容器进行目的蛋白的表达，Peptibody工程菌的湿重和目的蛋白的产量与实际生产仍有较大差距。

(2)IPTG是一种十分高效的乳糖操纵子诱导剂，少量的IPTG即可产生持久的诱导作用。但是IPTG价格昂贵，诱导成本过高会限制工业的规模化生产；同时，过高浓度的IPTG会抑制菌体生长，对人体具有潜在的毒性，生产过程中难以去除，部分国家已经禁止在生产人用重组蛋白时使用IPTG作为诱导剂。而且，IPTG诱导时目的蛋白累积过快，不能正确折叠导致包涵体的生成增多；IPTG在对数生长中期加入即可对菌体产生有效快速的诱导，但是诱导时机难以把握，稍有偏差便会使目的蛋白的产量受到较大影响。

(3)乳糖无毒且价格低廉，现有技术中将其作为IPTG的替代物对乳糖操纵子进行诱导。相比于IPTG通过扩散或者借助乳糖透过酶进入胞内，少量即可快速稳定诱导目的蛋白的表达，对菌体产生有效快速的诱导；乳糖则需要乳糖透过酶的转运才能进入胞内，经β-半乳糖苷酶转化为异乳糖才能起诱导作用，乳糖透过酶对乳糖的亲和力和转运速率都不如IPTG，且主动运输和转化过程会占用菌体能量，造成菌体生长减缓和目的蛋白表达滞后。利用乳糖作为诱导剂的诱导过程较IPTG更为复杂，乳糖诱导存在糖介导的诱导物排除作用，在培养基存在葡萄糖和甘油等碳源的情况下，乳糖诱导滞后，需要在碳源耗尽后才能启动乳糖操纵子；同时乳糖诱导较IPTG温和，但是菌体其他代谢能量充足，细胞壁合成完整，过硬的细胞壁不利于菌体的破碎和目的蛋白的释放。因此，如何实现Peptibody多表位疫苗的价廉、质优及高产的经济规模大生产还需对工艺条件等进行进一步的改进研究。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术生产Peptibody多表位疫苗的缺点与不足，提供一种Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺，对Peptibody多表位疫苗的生产方法进行了进一步的创新研究与完善，对生产工艺进行了放大和改进，通过将M₉培养基和乳糖诱导技术进行创新融合，实现了规模生产抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗。

本发明的另一目的在于提供所述的Peptibody多表位疫苗发酵生产方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺，包括如下步骤：