[发明专利]一套用于获取馆藏甲虫标本DNA条形码的Mini-Barcoding引物及其应用

说明书

本发明公开了一套用于获取馆藏甲虫标本DNA条形码序列的Mini‑Barcoding引物，由引物对Cocc301、Cocc286和Cocc214或引物对Cocc301和Cocc413或引物对Cocc301、Cocc286、Cocc214和Cocc658或引物对Cocc301、Cocc413和Cocc658组成。使用普通PCR或巢式PCR技术，通过扩增甲虫标本两段或三段目的基因片段，然后拼接成完整的馆藏甲虫标本DNA条形码序列。本发明设计的迷你条形码引物具有很好的扩增效率，克服了传统条形码引物扩增效率低的问题，尤其是对于年代久远的馆藏标本具有极高的扩增效率，使用本发明设计的引物可以高效的获取馆藏甲虫标本DNA条形码序列，丰富甲虫DNA条形码数据库，为利用DNA条形码鉴定甲虫提供参考。

技术领域

本发明属于昆虫分子鉴定技术领域，更具体地，涉及一套用于获取馆藏甲虫标本DNA条形码的Mini-Barcoding引物及其应用。

背景技术

甲虫是鞘翅目(Coleoptera)昆虫的统称。目前，世界甲虫种类已超过38万种，占昆虫总数的40％，是昆虫中数量最多的一个类群。甲虫丰富的生态多样性，使其在陆地和淡水生态系统中扮演着重要的角色。为适应多样的栖息地环境，甲虫在体型大小、形态和结构方面展现出极度的多样化。因此通过传统形态特征去鉴定和区分甲虫非常困难，尤其是在某些传统分类还不完善的类群中。所以，从分子层面鉴定和区分丰富的甲虫种类显得尤为重要。

Tautz等(2002)首先提出DNA分类的概念，以DNA序列为基础建立物种识别体系，利用DNA序列的差异进行种级阶元的分类。随后Hebert等(2003)提出DNA条形码的概念，即利用线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因(COI，Cytochrome oxidase)作为通用序列，建立全球性的物种鉴别系统。自DNA条形码提出以来，已在多个类群的研究中得到了应用。包括真菌、珊瑚、腹足类、昆虫、两栖类、鱼类等。

由于采集新鲜样本不仅费时费力，而且很难覆盖全面的物种种类，因此在获取瓢虫的DNA条形码序列时，经常会使用到馆藏标本。由于通常保存昆虫标本的方法都是针插，随着时间的推移，标本中的DNA会发生降解和断裂，因此很难使用通用引物来获取完整的DNA条形码序列。为解决此问题，Van Houdt等(2010)提出设计新的通用引物来扩增长为269～363bp的几个短片段，然后将其连接在一起得到条形码全长序列，然而所述引物存在扩增效率低的问题，而且不能用于检测馆藏时间较长的标本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一套用于获取馆藏甲虫标本DNA条形码的Mini-Barcoding引物组。

本发明的另一目的在于提供一套获取馆藏甲虫标本DNA条形码的方法。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案给予实现的：

一套用于获取馆藏甲虫标本DNA条形码序列的Mini-Barcoding引物组，由引物对Cocc301、Cocc286和Cocc214或引物对Cocc301和Cocc413或引物对Cocc301、Cocc286、Cocc214和Cocc658或引物对Cocc301、Cocc413和Cocc658组成；所述引物对Cocc301、Cocc286、Cocc214、Cocc413与Cocc658的序列依次如SEQ ID NO.1～10所示。

本发明以瓢虫COI基因序列为基础，设计了大量Mini-Barcoding引物组，最终筛选得到上述Mini-Barcoding引物组，通过使用所述引物组，利用普通PCR或巢式PCR技术，可以扩增馆藏甲虫标本两段或三段目的基因片段，然后拼接成完整的馆藏甲虫标本DNA条形码序列。通过采自1973～2013年的30头馆藏甲虫干标本来检验本发明上述引物组的扩增效率，结果表明所述Mini-Barcoding引物组具有很好的扩增效率，尤其是对于年代久远的馆藏标本具有极高的扩增效率，使用本发明设计的引物可以高效的获取馆藏甲虫标本DNA条形码序列，丰富甲虫DNA条形码数据库，为利用DNA条形码鉴定甲虫提供参考。