[发明专利]一种茶树热激蛋白CssHSP-6基因的重组载体和表达方法

说明书

本发明公开了一种茶树热激蛋白CssHSP‑6基因的重组载体，本发明还公开一种茶树热激蛋白CssHSP‑6基因的表达方法。本发明构建了茶树热激蛋白CssHSP‑6基因的原核表达载体，并且针对蛋白表达条件进行一系列的优化，最终得到CssHSP‑6可溶性蛋白，其结果为进一步研究蛋白晶体结构和生物学特性奠定基础，进而为通过基因编辑方法提高茶树的抗病性提供依据。

技术领域

本发明涉及一种茶树热激蛋白CssHSP-6基因的重组载体和表达方法，属于生物技术领域。

背景技术

茶树，原名：茶，山茶科、山茶属灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形。茶树的叶子可制茶(有别于油茶树)，种子可以榨油，茶树材质细密，其木可用于雕刻。分布主要集中在南纬16度至北纬30度之间，茶树喜欢温暖湿润气候，平均气温10℃以上时芽开始萌动，生长最适温度为20～25℃；年降水量要在1000毫米以上；喜光耐阴，适于在漫射光下生育；一生分为幼苗期、幼年期、成年期和衰老期。

热激蛋白是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白质，是生物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分,对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。它最早是1962年在果蝇中发现并于1974年首先分离得到，现已证明它普遍存在于动物、植物、微生物中。

基因的原核表达是研究基因功能的常用技术之一。蛋白原核表达时常常存在大肠杆菌中由于稀有密码子造成表达限制，形成包涵体；毒性较强的蛋白表达时会抑制蛋白的表达，造成表达产量过低；另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，导致表达产物不溶。针对上述难题，通常的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯化，然后复性。但此方法步骤繁琐，成功率低。目前茶树热激蛋白CssHSP-6基因已被发现，但如何将其以可溶性形式表达出来尚是本领域的难题。本发明通过选用不同的细菌菌株、采用不同的诱导温度以及诱导剂IPTG的浓度来筛选CssHSP-6蛋白可溶性表达的条件，为基因功能学、蛋白质晶体等研究打下基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种茶树热激蛋白CssHSP-6基因的重组载体和表达方法。

本发明的技术方案是：一种茶树热激蛋白CssHSP-6基因的重组载体，所述重组载体的制备方法如下：提取茶树叶片的RNA，并反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增CssHSP-6基因；将CssHSP-6扩增产物经EcoRI和XhoI双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pET-28a-CssHSP-6。

优选地，以cDNA为模板，利用以下引物扩增CssHSP-6基因，引物序列如下：

上游引物：CssHSP-6-F：GCGAATTCATGGCGATGATTCCAAG下划线为EcoRI酶切位点；

下游引物：CssHSP-6-R：CGCTCGAGTCAACCAGATATCTCAATAGACTTA下划线为XhoI酶切位点；

上下游引物分别如SEQ ID NO.3、4所示。

本发明还提供一种表达茶树热激蛋白CssHSP-6基因的方法，包括以下步骤：

(1)用权利要求1或1所述的重组载体转化大肠杆菌细胞，得到表达CssHSP-6的重组原核表达菌株；

(2)将重组原核表达菌株接种到卡那霉素液体培养基或卡那霉素+氯霉素液体培养基中，过夜培养活化菌株；

(3)将活化的重组原核表达菌株再转接到卡那霉素液体培养基或卡那霉素+氯霉素液体培养基中，震荡培养后加入IPTG诱导重组CssHSP-6的表达；

(4)诱导完成后，回收并纯化所表达的CssHSP-6重组蛋白。