[发明专利]基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒在审
| 申请号： | 201910358500.5 | 申请日： | 2019-04-30 |
| 公开（公告）号： | CN109913591A | 公开（公告）日： | 2019-06-21 |
| 发明（设计）人： | 张改平;郭振华;乔松林;邢广旭;陈鑫鑫;李睿;杨苏珍;赵东 | 申请（专利权）人： | 河南省农业科学院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙) 41122 | 代理人： | 张爱军 |
| 地址： | 450000 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 荧光定量 引物 探针序列 试剂盒 荧光定量RT-PCR 序列比对分析 病毒 技术支撑 鉴别诊断 快速鉴别 区域设计 保守性 水泡病 毒株 探针 猪群 诊断 感染 检测 分析 成功 | ||
1.基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，引物包括上游引物VP1-qFor和下游引物VP1-qRev，探针为VP1-Probe；各引物和探针的序列如下：
VP1-qFor：5’-CTCTGTCTCWTCCGTGCTTC-3’
VP1-qRev：5’-GTAAATRGTYCCCCAGTCAG-3’
VP1-Probe：5’-FAM-TCCAAGCTTTCTTCTGCCACGCGGGGT-BHQ1-3’。
2.一种基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1的引物和探针、Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye II、双蒸水。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照质粒标准品和阴性对照水。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，质粒标准品的制备方法为：以SVAcDNA为模板，利用VP1基因全长的特异性引物进行扩增，获得的目的基因片段经BamHI和SalI双酶切后连接至pE-SUMO Vector载体上，构建pE-SUMO-VP1重组质粒，经过测序鉴定后，测定其浓度并换算拷贝数，作为荧光定量RT-PCR检测的标准品。
5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，特异性引物包括上游引物VP1-For：5’-CGGGATCCATGTCCACCGACAACGCCGAGACTGG-3’和下游引物VP1-Rev：5’-CCGCTCGAGCTATTGCATCAGCATCTTCTGCTT-3’。
6.一种利用权利要求1所述引物和探针的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的RNA，反转录得到cDNA，作为模板；
(2)利用引物和探针进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果，判断样品中A型塞尼卡病毒的情况。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的反应体系为：Premix Ex TaqTM12.5μl、浓度均为5μM的上下游引物各1μl、浓度为5μM的探针1μl、ROXReference Dye II0.25μl、模板1μl，双蒸水8.25μl。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性20s；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于河南省农业科学院，未经河南省农业科学院许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201910358500.5/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
