[发明专利]基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT‑PCR检测方法和试剂盒，本发明荧光定量RT‑PCR检测方法所用引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，探针序列如SEQ ID NO.5所示。本发明的引物和探针是根据NCBI GenBank数据库中已发表的我国2015年以来流行的41株SVA的VP1基因序列，通过序列比对分析，在其保守的区域设计获得，引物和探针序列在所分析的毒株之间具有高度的保守性。本发明的荧光定量RT‑PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以成功用于临床SVA感染的鉴别诊断，为我国猪群中水泡病的快速鉴别诊断提供了良好的技术支撑。

技术领域

本发明涉及基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物、探针及其检测方法和试剂盒，属于生物工程技术领域。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，又称为A型塞尼卡病毒(SenecavirusA，SVA)，最初作为人胚肾细胞(PER.C6)培养过程中的污染物，于2002年被首次发现鉴定。现有研究表明，SVA也是引起猪原发性水泡病(porcine idiopathic vesicular disease，PIVD)的重要致病病原之一，并且可导致仔猪较高的死亡率。SVA属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，塞尼卡病毒属(Senecavirus)，病毒粒子无囊膜结构，为单股正链RNA病毒，基因组大小约7.3kb，包括两端的非翻译区(Untranslated regions，UTRs)和一个大的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码四个结构蛋白(VP1-VP4)和八个非结构蛋白(Lpro，2A-2C，3A-3D)。

目前，美国、加拿大、巴西、中国、柬埔寨和泰国等多个国家报道了SVA在猪群中的流行。自2015年以来，我国广东、福建、湖北、河南和黑龙江等多个省份也相继报道了SVA的感染和流行。SVA感染与口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和猪水泡病病毒(Swine vesicular diseasevirus，SVDV)感染引起的猪水泡性疾病均表现为口鼻部出现水泡、跛行、发热、厌食和精神沉郁等症状，在临床症状上难以区分。因此，对SVA引起的水泡性疫病进行快速、准确诊断对于该病的防控具有重要意义。此外，和其它小核糖核酸病毒科成员一样，SVA基因组在复制过程中具有很高的突变率，这为建立基于SVA核酸分子的临床检测诊断带来一定挑战。

SVA虽然早在2002年就被分离鉴定出来，但是一直以来对其致病性的研究却很有限。2014年以前，在NCBI GenBank的数据库中仅有3株SVA的全基因组序列信息，随着2015年以来SVA的感染和流行，SVA受到越来越多关注。目前实验室SVA病原学诊断技术主要包括病毒的分离鉴定、间接免疫荧光、RT-PCR和qRT-PCR等技术。qRT-PCR因其快速、高灵敏性和高特异性，在疫病的临床诊断中有越来越多的应用。我国现有的qRT-PCR检测方法多是根据美国2002年最早分离株SVV-001的基因组序列建立，且缺少针对临床样品检测的数据支撑，对当前新型流行毒株的检测效果并不确定。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物、探针及RT-PCR检测方法和试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物和探针，引物包括上游引物VP1-qFor和下游引物VP1-qRev，探针为VP1-Probe；各引物和探针的序列如下：

VP1-qFor：5’-CTCTGTCTCWTCCGTGCTTC-3’

VP1-qRev：5’-GTAAATRGTYCCCCAGTCAG-3’