[发明专利]一种玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的重组载体和表达方法

说明书

本发明公开了一种表达玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的重组载体，本发明还公开一种表达玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的方法。本发明构建了玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的原核表达载体，并且针对蛋白表达条件进行一系列的优化，最终得到CMU1可溶性蛋白，其结果为进一步研究蛋白晶体结构和生物学特性奠定基础，为设计针对CMU1为靶标的农药研制提供思路，进而为防治玉米黑粉菌提供依据。

技术领域

本发明涉及一种玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的重组载体和表达方法，属于生物技术领域。

背景技术

玉米黑粉菌是玉米的主要的病害之一，在玉米的整个生育期间皆可发生。但玉米黑粉菌在幼嫩时可以熟食，也可生食，有甜味，炒食另有风味。经常食用可预防和治疗肝脏系统和胃肠道溃疡，并能助消化和通便。在玉米黑粉菌中含有谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、组氨酸等16种氨基酸。此玉米黑粉菌可加工药用，将新鲜的孢子堆摘下或将老熟后的收集炼蜜丸，其性寒、味甘，有利肝脏益肝胃的作用，又可治神经衰弱，小儿疳积。

在植物与病原菌相互对抗的过程中，病原菌会分泌一些蛋白到寄主细胞中。这些蛋白被称为“效应蛋白(Avr)”，能够通过多种方式抑制植物免疫反应，促使病原成功侵染植物。近年来，不断的有病原菌效应蛋白基因被克隆的报道，如稻瘟菌、亚麻锈菌、卵菌、番茄叶霉菌、尖孢镰刀菌、油菜茎基溃疡病菌、大麦云纹病菌和玉米黑粉菌等中的效应蛋白基因也已先后被分离克隆。

基因的原核表达是研究基因功能的常用技术之一。蛋白原核表达时常常存在大肠杆菌中由于稀有密码子造成表达限制，形成包涵体；毒性较强的蛋白表达时会抑制蛋白的表达，造成表达产量过低；另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，导致表达产物不溶。针对上述难题，通常的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯化，然后复性。但此方法步骤繁琐，成功率低。目前玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因已被发现，但如何将其以可溶性形式表达出来尚是本领域的难题。本发明通过选用不同的细菌菌株、采用不同的诱导温度以及诱导剂IPTG的浓度来筛选CMU1蛋白可溶性表达的条件，为基因功能学、蛋白质晶体等研究打下基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种玉米黑粉菌效应蛋白CMU1 基因的重组载体和表达方法。

本发明的技术方案是：一种玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的重组载体，所述重组载体的制备方法如下：提取玉米RNA，并反转录出cDNA；以cDNA 为模板扩增CMU1基因；将CMU1扩增产物经EcoRI和XhoI双酶切后，通过 DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒 pET-28a-CMU1。

优选地，以cDNA为模板，利用以下引物扩增CMU1基因，引物序列如下：

上游引物：CMU1-F：GCGAATTCATGGCGGCTGTATCTGGC下划线为 EcoRI酶切位点；

下游引物：CMU1-R：CGCTCGAGTTAGGTGCACTTGTTGGCG下划线为 XhoI酶切位点；

上下游引物分别如SEQ ID NO.3、4所示。

本发明还提供一种表达玉米黑粉菌效应蛋白CMU1基因的方法，包括以下步骤：

(1)用权利要求1或2所述的重组载体转化大肠杆菌细胞，得到表达CMU1 的重组原核表达菌株；

(2)将重组原核表达菌株接种到卡那霉素液体培养基或卡那霉素+氯霉素液体培养基中，过夜培养活化菌株；

(3)将活化的重组原核表达菌株再转接到卡那霉素液体培养基或卡那霉素+ 氯霉素液体培养基中，震荡培养后加入IPTG诱导重组CMU1的表达；