[发明专利]一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法

说明书

本发明公开了一种高产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌株，菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae XY‑156A，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC M 2019129。本发明所述的酿酒酵母基因工程菌株XY‑156A，能够利用大量葡萄糖发酵生产丙酮酸，在分批补料发酵76h之后，发酵液中的丙酮酸浓度可达105g/L，丙酮酸得率为0.5g/g葡萄糖，在丙酮酸发酵生产中具有潜在应用价值。

技术领域

本发明涉及一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(pyruvic acid)，一种浅黄色至黄色的透明液体，广泛存在于人体、动植物及微生 体内，是细胞代谢过程中的重要中间产物；丙酮酸及其盐作为一类重要的平台化合物，在化 工、制药、农用化学品、食品保健等领域具有广泛应用。例如，丙酮酸及其盐是合成L-酪氨 酸、L-色氨酸、维生素B6、N-乙酰-D-神经氨酸、(R)-乙酰基苯甲醇等重要化合物的前体物 质；此外，在抗疲劳、增加耐力、降血脂、减肥等人类健康保健方面具有潜在应用。

目前，工业化生产丙酮酸主要采用化学合成法，主要是通过酒石酸和焦硫酸钾混合，酒 石酸发生脱水脱羧而生成丙酮酸，该方法操作简单，存在成本较高，产率低、污染环境等明 显缺点；与之相比，生物发酵法因具有原料来源广泛、成本低、反应条件温和、产生的丙酮 酸具有被生物膜识别的左旋结构光学活性等特点，因而更具有市场竞争优势。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)又称面包酵母或出芽酵母，被美国食品药物管理局 (FDA)认证为GRAS(Generally RegardedAs Safe)微生物，具有营养需求简单、产品分离工 艺成本低廉、能耐受低pH条件、对产物和底物的耐受性强、发酵产品具有安全性等优点； 并且S.cerevisiae作为真核模式微生物，遗传信息丰富，代谢改造操作简便，因而被认为是发 酵生产丙酮酸的潜在最适菌株。

由于野生型S.cerevisiae在长期自然进化过程中形成了偏好性产乙醇的机制，自身有机酸 (如丙酮酸、苹果酸等)积累量很低。而对于目标产物(丙酮酸)而言，乙醇的产生势必会 造成大量碳代谢流量和还原力浪费，丙酮酸不能大量积累；因此，乙醇合成途径的弱化或阻 断是实现S.cerevisiae大量积累丙酮酸的关键。对乙醇合成途径进行弱化或阻断的策略主要包 括：(1)缺失乙醇脱氢酶；(2)缺失丙酮酸脱羧酶；(3)同时弱化乙醇脱氢酶和丙酮酸。乙 醇脱氢酶缺失可完全消除乙醇的产生，但会造成毒性物质乙醛的大量堆积，对细胞产生严重 的毒害作用。丙酮酸脱羧酶是乙醇代谢路径上游的限速酶，该酶受三个结构基因(pdc1、pdc5、 pdc6)表达调控。其中，pdc1和pdc5在葡萄糖为碳源的培养基中表现活性，pdc6则在非葡 萄糖碳源如乙醇、乳糖等中表现活性。同时敲除pdc1、pdc5和pdc6，获得的工程菌株则无法 在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长，但通过对菌株进行驯化和筛选，可获得能利用葡萄糖 并大量积累丙酮酸的菌株。近年来，有关改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究取得了一定的成果， 如，Yuma Ito等敲除了酿酒酵母的adh1、adh2、adh3、adh4、adh5得到工程菌株S149，该 菌株乙醇产量有了明显降低，但仍有乙醇产生，而且由于乙醛的大量堆积，菌株生长缓慢。 天津科技大学的邓旭衡以Saccharomyces cerevisiae Y2为出发菌株，通过敲除pdc1和pdc5最 终获得工程菌株S.cerevisiae Y2-15，并在后续发酵实验中利用该菌株以80g/L葡萄糖为底物 发酵96h，最终获得的丙酮酸浓度为24.85g/L，产率为0.26g/(L.h)。Wang等以丙酮酸脱羧酶 缺陷菌株pdc-S.cerevisiae BY5419为出发菌株，通过定向进化策略筛选到一株能够利用葡萄 糖发酵生产丙酮酸的工程菌株BY5419-A₀，后期利用该菌株分别在葡萄糖浓度为100g/L和 150g/L的YPD培养基条件下进行发酵120h，获得的丙酮酸浓度分别为64.8g/L、66.4g/L， 产率分别为0.54g/(L.h)、0.55g/(L.h)，发酵过程中并没有乙醇产生。