[发明专利]一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法及探针

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法，该方法的检测体系中含有：crRNA、Cas13a、探针；该方法的特征在于：所述的探针包含1段RNA序列，该RNA序列的两端分别连接1段DNA序列；所述探针上的核苷酸均进行硫代磷酸骨架的修饰，以在相邻核苷酸之间形成硫代磷酸酯键；所述RNA序列上的若干个核苷酸还进行了二甲氧基修饰，并且，所述的RNA序列上至少含有两个连续的未进行二甲氧基修饰的核苷酸。所述的DNA序列含有6个脱氧核糖核苷酸。所述的RNA序列含有为8‑12个核糖核苷酸。本发明设计的探针稳定高，荧光背景值低。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法及探针。

背景技术

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统，被用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)的简称，涉及细菌基因组中的独特DNA区域，也是储存病毒DNA片段从而允许细胞能够识别任何试图再次感染它的病毒的地方，CRISPR经转录产生的RNA序列识别入侵性病毒的遗传物质。Cas是CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)的简称，Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割细菌基因组上的靶DNA。CRISPR-Cas系统是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)来发挥功能。其中，Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2(C2c2也被称作Cas13a)均具有RNA介导的核酸内切酶活性。

2017年Science期刊在线发表论文标题为“Nucleic acid detection withCRISPR-Cas13a/C2c2”的文章，公开了一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法，引发了全球公共卫生领域的广泛关注。研究人员将一种靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相关酶(即Cas13a)改造为一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断工具，能够指示最少至一个靶RNA或DNA分子的存在。这种新的工具被称为“SHERLOCK(Specific High-sensitivityEnzymatic Reporter unLOCKing)”。SHERLOCK”系统除了包含Cas13a以及对应的靶向待检测病毒的crRNA外，还包含一个切割后可发出荧光的RNA探针。Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标RNA，就会转入一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其它的非靶标RNA，而不管它们是否与crRNA同源。此时检测系统中的RNA探针被Cas13a核酸酶识别并切割，发出荧光信号，表明已经检测到了靶标序列的存在。