[发明专利]一种香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体及其小RNA

权利要求书

1.一种香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体，其特征在于，所述香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体为以下3种香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体中的任意一种：Δago1突变体、Δago2突变体和Δago1/2突变体；

所述Δago1突变体、Δago2突变体和Δago1/2突变体通过以下方法获得：

1)构建Foc4 AGO1基因缺失重组DNA片段，采用潮霉素抗性基因HPH替换AGO1基因，原生质体转化，获得Foc4 AGO1基因缺失突变体，即Δago1突变体；采用相同的方法敲除AGO2基因，构建Δago2突变体；

2)在Δago1突变体的基础上构建Foc4 AGO1/2双基因缺失重组DNA片段，采用新霉素NEO抗性基因替换AGO2基因，原生质体转化，获得Foc4 AGO1/2双基因缺失突变体，即Δago1/2突变体。

2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体，其特征在于，步骤1)Δago1突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：以FOC4基因组DNA为模板，Foc4AGO1-LBCK和Foc4AGO1-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1993bp；

右端RB：以FOC4基因组DNA为模板，Foc4AGO1-HPH-RB-F和Foc4AGO1-RBCK为引物，扩增产物大小1988bp；

潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，Foc4AGO1-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2415bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和FOC4AGO1-RB-R为引物，扩增产物大小2274bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4 AGO1基因缺失突变体，即Δago1突变体；

其中，Foc4AGO1-LBCK、Foc4AGO1-HPH-LB-R、Foc4AGO1-HPH-RB-F、Foc4AGO1-RBCK、Foc4AGO1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和Foc4AGO1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示。

3.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体，其特征在于，步骤1)Δago2突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：FOC4基因组DNA为模板，Foc4 AGO2-LBCK和Foc4AGO2-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1840bp；

右端RB：FOC4基因组DNA为模板，Foc4AGO2-HPH-RB-F和Foc4AGO2-RBCK为引物，扩增产物大小1900bp；

潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，Foc4AGO2-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2411bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和Foc4AGO2-RB-R为引物，扩增产物大小2134bp；

其中，Foc4 AGO2-LBCK、Foc4AGO2-HPH-LB-R、Foc4AGO2-HPH-RB-F、Foc4AGO2-RBCK、Foc4AGO2-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和Foc4AGO2-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:17所示。