[发明专利]一种香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体及其小RNA

说明书

本发明公开了一种香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体及其小RNA。采用同源置换的原理，构建了香蕉枯萎菌Δago1、Δago2和Δago1/2基因缺失突变体，并进行了非生物胁迫测试和致病力分析，结果显示经过荧光增白剂CFW处理后，Δago2缺失突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl₂处理后，Δago1突变体、Δago2突变体和Δago1/2突变体的生长均受到抑制。Δago1突变体致病力增强，Δago2突变体和Δago1/2突变体致病力减弱；此外，结合小RNA深度测序获得各突变体小RNA，为进一步解析香蕉枯萎病的致病机制，开发RNA来源的防控措施等提供理论和技术支撑。

技术领域

本发明涉及一种香蕉枯萎菌4号生理小种AGO基因缺失突变体及其小RNA，属于生物工程技术领域。

背景技术

小分子RNA是在真核生物中广泛存在的一类21-24nt的非编码RNA，包括miRNA(microRNA)和siRNA(small interfering RNA)，它可以与含Argouaute(AGO)蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体RISC(RNA induced silencing complex)，通过剪切靶标mRNA或翻译抑制的方式导致序列特异性的转录后基因沉默调控。AGO蛋白是RISC复合体中的重要组分，在小RNA介导的基因沉默中发挥重要作用。AGO蛋白全长700-1200个氨基酸残基，包含四个结构域，分别是N末端、PAZ、MID和PIWI结构域。Dice切割dsRNA产生5'端磷酸基、3'端羟基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs后，与含有PAZ功能域的AGO蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体，该复合体具有序列特异性的核酸内切酶活性，能够特异性的降解与siRNA同源的靶标mRNA。

RNA沉默(RNAsilencing)或基因沉默(gene silencing)是广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生物中的一种高度保守的、序列特异的RNA降解机制。RNA基因沉默是在秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)发现的由双链RNA(dsRNA)以序列特异性方式发生转录后沉默(post transcriptional silencing,PTGS)的现象(Fire et al.,1998)。Romano和Macino将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)内源基因al-1的同源片段导入后，发现albino-1基因的表达受到抑制，他们将这种现象称为RNA静息(quelling)(RomanoandMacino,1992)。随后，研究者获得了一系列quelling功能缺失突变菌株，对这些突变株的研究证明了quelling途径与siRNAs相关(Cogoni and Macino,1997)。其中，QDE-1编码细胞依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)，而RdRP是其他真核生物RNAi所必需的重要组成元件(Cogoni and Macino,1999)。此外，QDE-2基因编码一个含有piwi-PAZ结构域的Argonaute蛋白，是秀丽小杆线虫RDE-1(RNAi-deficient-1)的同源蛋白，是真核生物RNA沉默途径中重要的保守元件之一。QDE-3编码的蛋白属于RecQ家族DNA螺旋酶，参与同源重组，DNA复制和DNA修复(Cogoni and Macino,1997)。