[发明专利]一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法。本发明研究发现了一种HPV核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现HPV核酸检测，并构建了基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测系统和检测试剂盒。该技术对HPV核酸检测特异性好、灵敏度高，能够实现多病毒亚型同时检测；该技术操作方便快捷，可在25‑37℃的室温下进行，检测成本低廉，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法。

背景技术

人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒感染引起的一种性传播疾病。主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，HPV16和18型长期感染可能与女性宫颈癌有关。为实现HPV的早期检测并使耐药菌传播减至最小，开发低成本、准确、高效、快速地检测HPV相关特异基因的诊断方法非常重要。

使用经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，但是由于酶表达的可变水平以及一些抗生素组合的不良特异性，传统的检测方法耗时并且准确性不高。如(1)分离培养技术：病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体金标准鉴定技术。该方法存在对的问题主要有：分离培养耗时长，往往需要几天时间，无法实现短时间内迅速得到检测结果，且必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。

基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-Sanger测序技术、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有HPV检测技术的缺陷和不足，研究发现了一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现高灵敏、高精度的HPV核酸检测。

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测位点及gRNA组合。

本发明另一目的是提供一种HPV基因的CRISPR/Cas12a检测系统。

本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。

所述HPV核酸检测靶标位点的序列如SEQ ID NO.1-9任一所示。

同时所述靶标位点在作为HPV核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测位点方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。