[发明专利]一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：

弓形虫速殖子的收集

复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0 μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为所需速殖子；

目的基因片段的扩增

收集速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取RNA逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行TgUba1^210-750编码序列，即SEQ NO.2的PCR扩增；反应体系为：cDNA 1 μl，10 nmol/L上、下游引物即SEQ NO.3和SEQ NO.4各0.5 μl，2 × Ex Taq酶混合物12.5 μl，加去离子水至25 μl；反应条件为：95 ℃ 1 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共35个循环；72℃7 min；扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，观察到有明显的、大小正确的目的条带后表明扩增成功，利用切胶回收获得PCR产物；

原核表达质粒的构建和鉴定

用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物，酶切完全的载体和目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16 ℃条件下连接过夜；经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于含50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，筛选阳性克隆，提取质粒；重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液测序；

TgUba1^210-750蛋白诱导表达与鉴定

将测序正确的质粒pET28b-TgUba1^210-750热激法转化感受态细胞后，涂板于含50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，自含50 μg/ml卡那霉素的诱导培养基中37 ℃振荡培养24 h；将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃、12000×g离心10min，取上清行质量百分数为10 %的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗，1:1 000，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，1:50 000；待鉴定出有明显预期目标大小的目的条带后进行下一步实验；

蛋白纯化和免疫

将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1^210-750蛋白，以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1 mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5 mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫；免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测；待血清效价大于1 : 32 000后，常规心脏取血，收集血清进行抗体纯化，即得刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体，于－80℃保存。

2.根据权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。

3.根据权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤中弓形虫为RH株。

4.根据权利要求1至3任一项所述的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤中感受态细胞为Rosatte(DE3) 感受态细胞。

5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体在制备特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。