[发明专利]用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架及其制备方法

权利要求书

1.用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架，其特征在于：该支架以丝素蛋白、酪胺根接枝改性明胶、辣根过氧化物酶为浆料，利用3D打印技术构建多孔水凝胶支架，通过双氧水浸泡实现酶交联，进一步利用醇溶液处理增强力学性能。

2.权利要求1所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)打印材料制备

1.1)酪胺根接枝改性明胶的制备：配置500ml浓度为50mM吗啉乙磺酸缓冲液，加入10g明胶粉末，在50℃下搅拌、溶解充分，加入5g酪胺盐酸盐，搅拌、溶解充分，溶液冷却至室温后，依次加入羧基活化剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化明胶分子链上的羧基，室温下反应12h；将反应产物装入截留分子量为10000-12000的透析袋中，去离子水环境下透析4天，最后利用冷冻干燥机除去水分，得到白色海绵状改性产物，防潮柜中储存，备用；

1.2)丝素蛋白溶液的制备：在烧杯中加入4g脱胶蚕丝，随后加入9.3mol/l溴化锂溶液20ml；将烧杯置于60℃水浴锅中加热溶解脱胶蚕丝4h；充分溶解后，将溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中，去离子水环境下透析3天，每天换2-3次水；透析结束后，将透析袋中的溶液在离心机中离心两次，除去不溶杂质；离心结束后，获得澄清丝素蛋白溶液，丝素蛋白溶液的浓度通过烘干比重法获得，置于4℃冰箱中保存备用，三周内使用；

2)打印浆料的配置

将改性明胶加入稀释至规定浓度的丝素蛋白溶液中，在50℃下溶解约2h，充分混匀；待明胶溶解后加入辣根过氧化物酶；混匀后转移至料筒中，备用；其中，明胶浓度为15wt％、丝素蛋白浓度为0～5w/v％、辣根过氧化物酶浓度为30～240Units/ml；

3)水凝胶支架的打印和后处理

将步骤2)中装有打印浆料的料筒转移到3D打印机中，将料筒温度和打印沉积平台温度设定好后，让料筒进行保温；设定好支架内部和外部结构的参数后，通过调试挤出压力、牵伸速度后开始打印；打印结束后，将打印得到的结构浸泡双氧水溶液，引发丝素蛋白和改性明胶间的酶催化交联；最后进一步用醇溶液处理酶交联后的水凝胶支架，促进丝素蛋白构象转变，以增强支架的力学性能；处理结束后，用去离子水清洗三遍去除残留的醇溶液，得到一种3D打印丝素蛋白/明胶水凝胶支架。

3.根据权利要求2所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于：在步骤1.1)中，所述羧基活化剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用量分别为：0.37g、0.11g。

4.根据权利要求2所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述料筒温度设定为28～30℃，平台温度为4～8℃。

5.根据权利要求2所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述支架外部结构的形状和尺寸能够根据实际需求进行设计；所述支架内部结构为间距为0.4～1mm的纤维丝，每两层纤维丝间夹角为90°，层厚为180μm～400μm。

6.根据权利要求2所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述挤出压力为1.5～4bar；所述牵伸速度为10～20mm/s。

7.根据权利要求2所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述双氧水浓度为5～10mM，浸泡时间为30～60min。

8.根据权利要求2所述的用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述醇溶液为70～90w/v％甲醇或乙醇水溶液，浸泡时间为6～10h。