[发明专利]用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架及其制备方法，该支架以丝素蛋白、酪胺根接枝改性明胶、辣根过氧化物酶为浆料，利用3D打印技术构建多孔水凝胶支架，通过双氧水浸泡实现酶交联，进一步利用醇溶液处理增强力学性能。本发明支架结合了明胶和丝素的优异特性，具有良好生物相容性、力学性能以及压缩抗疲劳性能，可以应用于软骨组织再生修复。

技术领域

本发明涉及生物医用材料的技术领域，尤其是指一种用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架及其制备方法。

背景技术

软骨组织一旦缺损很难实现自修复，虽然临床上已有许多技术应用于软骨缺损的治疗，但各种疗法都存在不足。组织工程软骨的研究与开发为软骨缺损的修复带来了新思路。软骨支架材料需具备良好的生物相容性、与软骨组织再生相匹配的降解速率和力学性能等特性；软骨组织工程支架的构建有方式有许多，相比于一些传统支架成型方式，3D打印可以更精确地控制支架的结构。水凝胶具有与人体软组织相似的结构和含水量，近年来3D打印水凝胶的研究也备受瞩目，也取得了许多成果。

3D打印水凝胶对于材料有一定的要求，利用明胶温敏性实现3D打印可以获得保真度较好的三维结构。将明胶作为软骨修复材料，其优势在于分子链上据悉可供细胞识别黏附的位点，具有很好的生物相容性，但明胶也存在力学性能差、体内降解时间短等缺陷。相反，丝素蛋白作为一种从蚕丝中提取出来的天然高分子，具有较好的力学性能以及相对可控的降解速率，但是天然丝素蛋白分子链上没有细胞粘附位点，不利于细胞在其上的迁移、粘附和生长。将二者进行结合构建3D打印支架可以实现两种材料的优势互补。

辣根过氧化物酶催化交联是一种快速、温和的交联方式。明胶可以通过在分子链上修饰酪胺根，从而实现酶交联；而天然丝素蛋白分子链本身就具有可供酶催化交联的酪氨酸残基。通过酶交联反应可以将二者进行共价交联，以实现二者的优势互补。此外，酶交后的丝素蛋白水凝胶，再经醇溶液处理引发构象转变后可以显著增强水凝胶的力学性能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架及其制备方法，该支架结合了明胶和丝素的优异特性，具有良好生物相容性、力学性能以及压缩抗疲劳性能，可以应用于软骨组织再生修复。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架，该支架以丝素蛋白、酪胺根接枝改性明胶、辣根过氧化物酶为浆料，利用3D打印技术构建多孔水凝胶支架，通过双氧水浸泡实现酶交联，进一步利用醇溶液处理增强力学性能。

所述用于软骨修复的3D打印丝素/明胶支架的制备方法，包括以下步骤：

1)打印材料制备

1.1)酪胺根接枝改性明胶的制备：配置500ml浓度为50mM吗啉乙磺酸缓冲液，加入10g明胶粉末，在50℃下搅拌、溶解充分，加入5g酪胺盐酸盐，搅拌、溶解充分，溶液冷却至室温后，依次加入羧基活化剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化明胶分子链上的羧基，室温下反应12h；将反应产物装入截留分子量为10000-12000的透析袋中，去离子水环境下透析4天，最后利用冷冻干燥机除去水分，得到白色海绵状改性产物，防潮柜中储存，备用；

1.2)丝素蛋白溶液的制备：在烧杯中加入4g脱胶蚕丝，随后加入9.3mol/l溴化锂溶液20ml；将烧杯置于60℃水浴锅中加热溶解脱胶蚕丝4h；充分溶解后，将溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中，去离子水环境下透析3天，每天换2-3次水；透析结束后，将透析袋中的溶液在离心机中离心两次，除去不溶杂质；离心结束后，获得澄清丝素蛋白溶液，丝素蛋白溶液的浓度通过烘干比重法获得，置于4℃冰箱中保存备用，三周内使用；

2)打印浆料的配置