[发明专利]一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物及试剂盒

权利要求书

1.一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物组，其特征是包括五种病原SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VP_AHPND 的引物，其中：

所述病原SHIV的外扩引物序列如SEQ IDNO.1～2所示；

所述病原SHIV的内扩引物序列如SEQ IDNO.3～4所示；

所述病原EHP的外扩引物序列如SEQ IDNO.5～6所示；

所述病原EHP的内扩引物序列如SEQ IDNO.7～8所示；

所述病原WSSV的外扩引物序列如SEQ IDNO.9～10所示；

所述病原WSSV的内扩引物序列如SEQ IDNO.11～12所示；

所述病原IHHNV的外扩引物序列如SEQ IDNO.13～14所示；

所述病原IHHNV的内扩引物序列如SEQ IDNO.15～16所示；

所述病原V_PAHPND 的外扩引物序列如SEQ IDNO.17～18所示；

所述病原VP_AHPND的内扩引物序列如SEQ IDNO.19～20所示。

2.一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR检测试剂盒，其特征是：包括外扩反应液、内扩反应液、阳性对照和阴性对照；其中所述外扩反应液包括权利要求1中的外扩引物、dNTP、EX Taq enzyme和ddH₂O，所述内扩反应液包括权利要求1中的内扩引物、dNTP、EX Taq enzyme和ddH₂O。

3.根据权利要求2中的试剂盒，其特征是：所述外扩反应液为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX Taq enzyme 1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VP_AHPND 五种典型病原的外扩上下游引物浓度均为0.32μmol/L；所述内扩反应液为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX Taq enzyme 1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VP_AHPND 五种典型病原的内扩上下游引物浓度均为0.48μmol/L。

4.采用权利要求1中所述引物组检测养殖对虾五种典型病原的非疾病检测目的多重巢式PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：

(1)构建阳性质粒DNA作为对照；

(2)提取待测样品的DNA；

(3)外扩PCR反应：构建外扩PCR反应体系和外扩PCR反应程序，进行外扩PCR反应，获得外扩产物，并以各病原的阳性质粒DNA和无菌水分别作为阳性和阴性对照；

(4)内扩PCR反应：构建内扩PCR反应体系和内扩PCR反应程序，对稀释后的外扩产物进行内扩PCR反应，获得内扩产物；

(5)PCR结果判断：采用电泳检测内扩产物，如出现和阳性对照片段大小一致的阳性条带，则该样品携带相应的目标病原。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述外扩PCR反应体系为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX Taq enzyme 1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VP_AHPND五种病原的外扩上下游引物浓度均为0.32μmol/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述的外扩PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是：步骤(4)中所述内扩PCR反应体系为25μL反应体系，其中：dNTP浓度为1.5mmol/L，EX Taq enzyme 1.5U，SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VP_AHPND五种病原的内扩上下游引物浓度均为0.48μmol/L。