[发明专利]一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物，包括五种病原SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPsubgt;AHPND/subgt;的引物组，其中：所述引物组的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～20所示，本发明还公开了包含上述引物的试剂盒以及采用上述引物检测五种病原的非疾病检测目的多重巢式PCR检测方法，通过设计外扩和内扩引物，优化并确定外扩和内扩反应的退火温度、dNTP、EX Taq enzyme、五种对虾病原引物的PCR反应浓度等参数，一方面保证可满足同时检测对虾养殖生产危害较大的SHIV、EHP、WSSV、IHHNV和VPsubgt;AHPND/subgt;等五种病原的需求，另一方面可达到较高的灵敏度。

技术领域

本发明属于对虾病原检测技术领域，具体涉及一种同时检测养殖对虾五种典型病原的多重巢式PCR扩增引物及试剂盒，更涉及一种多重巢式PCR扩增引物及采用所述引物同时检测五种典型病原的非疾病检测目的多重巢式PCR检测方法及应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾、白虾，原产于美洲太平洋沿岸水域，因具有对盐度适应性广、生长快、肉质鲜美、营养需求低、适应性强等优点而深受大众喜爱。据中国渔业统计年鉴显示，2017年南美白对虾养殖总产量占全国总产量的75％以上。虽然南美白对虾的经济效益以及年产量总体呈上升趋势，但是从2015-2017年南美白对虾养殖产量为增长缓慢阶段，产业发展遇到了瓶颈。其中一个重要原因是病害影响日趋严重，在养殖生产过程中一旦发生小规模的病害，若处理控制不当即可能直接导致爆发性蔓延，造成巨大损失。据郑晓叶等研究发现，常见病原对我国南美白对虾主养区虾苗的感染情况不容乐观，且目前发现的对虾易感病症大多尚无有效治愈手段。对此，有必要对常见病原做详细了解以实时掌握养殖池动态，将损失降到最低。据梁静真、王博雅、武和英和张娜等人于2013-2018年对我国不同地区病原调查研究显示，不同地区病害的种类及流行情况不尽相同，主要以虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、嗜盐的副溶血性弧菌(VibrioparahaemolyticusAHPND,VP_AHPND)白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hernatopoietic necrosisvirus，IHHNV)等五种病原为主。2015和2016年梁静真等人在广西沿海地区凡纳滨对虾WSSV的阳性率分别为30.4％和41.9％；王博雅(2017)等在辽宁省26个对虾发病池塘中检出的IHHNV阳性率为65.4％，EHP阳性率为34.6％。武和英等在2017年间在对养殖场病原跟踪调查中发现几乎在所有跟踪调查的养殖池中均检出EHP和VP_AHPND。2017年4～6月王甘翔等在浙江省平湖市调查发现该市出现因SHIV感染而导致养殖池对虾连片死亡的现象。

可见，及早开展对虾病原检测，掌握虾苗和养殖水体、投入品等病原携带情况，对对虾养殖生产意义重大。现有的对虾病原检测技术方法主要有组织病理学诊断、胶体金免疫层析技术检测法和分子生物学方法等。分子生物学方法以其简捷、方便、灵敏度高等优点，在对虾病原检测中应用越来越广泛。在相关病原检测技术研发方面，中国水产科学研究院黄海水产研究所黄倢团队研发了针对SHIV病原的巢式PCR检测技术、针对EHP和IHHNV病原的荧光定量PCR检测技术和TaqMan探针荧光定量PCR检测技术，以及针对VP_AHPND病原的荧光定量PCR检测技术；中山大学何建国团队研发了针对WSSV病原PCR检测技术、原位杂交检测技术和巢式PCR检测技术；自然资源部第三海洋研究所杨丰团队研发了针对红螯螯虾虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus,CQIV)、EHP和VP_AHPND等病原的荧光定量PCR检测技术，及其多重荧光定量PCR检测技术。