[发明专利]一种利用基因重组制备利拉鲁肽中间体多肽的方法

权利要求书

1.一种利用基因重组制备利拉鲁肽中间体多肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(a)将利拉鲁肽中间体基因进行密码子优化以利于其在大肠杆菌中高效表达，并将其构建到表达载体pET-41a中，得到重组表达载体pET-41a-GST-DDDDK-利拉鲁肽中间体，表达出的重组蛋白为GST-DDDDK-利拉鲁肽中间体；

(b)将步骤(a)中构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21，用IPTG诱导其发酵表达重组蛋白，离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬后超声破碎细胞，离心获得上清液；

(c)将上清液过滤除菌体后，过GST亲和纯化柱吸附重组蛋白GST-DDDDK-利拉鲁肽中间体，之后用Tris-HCl洗脱缓冲液(含10-40mM还原型谷胱甘肽)洗脱并收集重组蛋白；

(d)得到的重组蛋白用重组牛肠激酶(EK)酶切12-16h；

(e)酶切后的混合液调pH，再次过GST柱除去杂蛋白，过柱滤液即为纯度较高的利拉鲁肽中间体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，其基因序列如SEQ ID NO.1所示设计的引物序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：含有步骤(a)中所述融合蛋白编码基因的重组表达载体。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中重组表达载体，其特征在于将利拉鲁肽中间体基因片段克隆进入pET-41a载体获得重组表达载体pET-41a-GST-DDDDK-利拉鲁肽中间体。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中将标签蛋白GST和牛肠激酶酶切位点DDDDK基因片段连接到利拉鲁肽中间体基因的5‵端，由此构成的表达载体pET-41a-GST-DDDDK-利拉鲁肽中间体。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中将表达载体体pET-41a-GST-DDDDK-利拉鲁肽中间体转入到大肠杆菌BL21菌株，发酵诱导融合蛋白表达。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)中的菌株用于获得利拉鲁肽中间体重组蛋白，进一步获得利拉鲁肽中间体。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(c)中用GST树脂纯化发酵液上清中的融合蛋白。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(d)中用重组牛肠激酶对融合蛋白进行酶切，得到利拉鲁肽中间体粗品。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(e)中通过GST树脂除去利拉鲁肽中间体粗品中的杂质标签蛋白，得到纯度较高的利拉鲁肽中间体直接进行下一步连接脂肪酸侧链的反应。