[发明专利]一种利用基因重组制备利拉鲁肽中间体多肽的方法

说明书

本发明专利涉及生物医药领域，是一种利拉鲁肽中间体多肽即Arg34‑GLP‑1(7‑37)的合成方法，包括如下步骤：优化利拉鲁肽中间体基因，并构建其重组表达载体；转化大肠杆菌BL21，发酵并诱导其融合蛋白表达；之后通过超声破碎细胞、亲和纯化、酶切、过亲和层析柱除杂来获得纯度较高的利拉鲁肽中间体。利用基因重组方法避免了化学合成法中繁琐的制备、纯化步骤以及过多的杂质、污染物的产生以及较长的生产周期。与前面的方法相比，简化了生产过程，降低了生产成本和污染物的产生，更利于规模化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法。

技术背景

糖尿病是一种常见的慢性疾病，其症状包括尿液分泌过多、常有饥饿感、体重减轻、视力减退等。持续性血糖浓度升高还容易引发心脏、血管、眼睛、肾脏和神经等多种组织器官病变，影响人的身体健康。2017年全球有4.25亿糖尿病患者，在所有国家中，中国糖尿病负担最重，患者人数(1.14亿)占全球近27％。预计2045年，全球糖尿病患者将进一步加重，人数可达7亿。

利拉鲁肽(Liraglutide)是的人胰高血糖素样肽—1(GLP-1)类似物，于2009年在欧盟上市，并于2011年获我国国家食品药品监督管理局批准用于治疗成人Ⅱ型糖尿病，每日给药一次。它以葡萄糖浓度依赖性机制，促进胰岛细胞分泌胰岛素，发挥降糖作用。利拉鲁肽目前是由诺和诺德公司利用酿酒酵母以胞外分泌方式表达利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)，并连接16碳棕榈脂肪酸侧链后切除多余氨基酸，获得利拉鲁肽分子。利拉鲁肽作为进口药在国内销售，价格昂贵以致大多数国内患者无法承受得起，因此国内迫切需要开发出自己的一套利拉鲁肽制作工艺，使得利拉鲁肽的价格能大幅度降低，从而使广大患者得到有效的治疗。

利拉鲁肽的化学名称为Arg34Lys26-(N-ε-(y-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1，分子式为C172H265N43O51，，分子量为3751.20Da，它与天然GLP-1有97％的同源性。利拉鲁肽除了有降糖作用，还可以抑制胃排空、增加饱腹感、减轻体重。

利拉鲁肽结构式如下：

NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH

由以上结构式所示，利拉鲁肽是在天然GLP-1分子中将34位的Lys变为Arg，并在Lys26上连接一条16碳棕榈脂肪酸侧链，得到利拉鲁肽分子。脂肪酸侧链一方面可以增加利拉鲁肽与血液中白蛋白的可逆结合时间，另一方面可以其在皮下注射部位自交联成七聚体，延缓皮下对其吸收，此两方面可以增加利拉鲁肽的作用时间。

化学合成方法主要还是通过氨基酸一个一个链接，中国专利也公开了一系列化学合成方法，如CN105732798、CN102875665、CN102286092 A等。对于利拉鲁肽这样的长链多肽来说，虽然可以通过固相自动化合成，但生产周期长，产率低。而通过化学液相分段合成，虽然可以有效减少合成的周期，但同样会产生大量不易被回收利用的废液。

国内报道的生物法合成利拉鲁肽中间体专利如CN108191981A一般有两种获取利拉鲁肽中间体的方法：一是处理超声破碎后的包涵体，主要缺点是用到大量尿素进行变性，之后稀释复性的复性效率很低进而不利于酶切得到目的多肽；二是从超声破壁后的上清中纯化，因为上清的蛋白有天然活性，利于后续酶切，通过亲和纯化得到的目的多肽纯度也会相对很高。如果选择更为简便的纯化工艺将有利于进一步降低成本和较少污染物的产生。

发明内容

本发明提供一种利用基因重组制备利拉鲁肽中间体多肽的方法，该方法进一步降低生产成本，减少污染物排放。