[发明专利]一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法

说明书

本发明公开了一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK‑2‑HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。该报告基因以对神经分化过程中或肌肉、心肌分化过程中产生的特异性miRNA进行实时、定量的监控。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNA，miR)是由20到22个非编码核苷酸组成的小分子单链RNA，可通过抑制翻译或降解mRNA来调控基因的表达。这些分子与许多细胞的活动，诸如分化分生，增殖凋亡有着密切关系。又因其可诱导特定mRNA降解或抑制翻译，所以在很多临床上重要的疾病中也发挥着重要的作用。一些miRNAs已经被证实与心肌以及肌肉的分化过程有关，如miR-1，miR-133，miR-181，miR-195，miR-206，and miR-26a。还有些miRNAs被发现与神经分化进程有着密切关系，例如miR-9，miR-124等。

目前用于监控miRNAs表达的传统手段主要有Northern杂交(Northern blot)、基因芯片(microarray)、实时定量PCR(real-time polymerase chain reaction)技术等。通过传统手段，并不能将细胞活动过程内动态miRNA的表达变化得以完全以及可重复性地表现出来。而且这些传统技术在监测过程中大多要求破坏生物组织，导致细胞水平的裂解或死亡，既耗费时间精力，又不能在活体水平加以检测。目前主要用的分子成像发光手段包括生物荧光与自发荧光两方面。运用了分子信标、放射性同位素标记、报告基因系统等手段。分子信标面临的问题主要是所带显色基团是否足够稳定，在不发生结合时荧光淬灭能力极其本身所带的背景荧光值过高；而放射性同位素则会对生物体造成一定程度的损伤；存在的报告基因系统为switch-Off系统，不能确定是随着时间的流逝所造成的荧光表达下降还是报告基因系统的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无创、实时在体检测miRNA表达水平的报告基因及其构建方法，实现对神经分化过程或肌肉分化过程中相关miRNA的动态监控。为深入研究对相关神经疾病模型或肌肉萎缩疾病中，分子表达水平对其所产生的调控奠定基础。

为了实现上述技术效果，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种监测miRNA动态变化的报告基因，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK-2-HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。

本发明所述的报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了所述的监测miRNA动态变化的报告基因的制备方法，包括以下步骤：

1)将PUF基因克隆到质粒psiCHECK-2-HM471G多克隆位点上，得到质粒psiCHECK-2-HM471G-PUF；

2)将Fluc基因克隆到psiCHECK2-HM471G上，获得psiCHECK2-HM471G-Fluc；

3)利用miRNA与靶标通过碱基互补配对的形式相互作用，将与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列克隆到上，获得psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR-Fluc；