[发明专利]一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用

权利要求书

1.一种鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

SS1：提取鸡传染性支气管炎病毒疫苗株的RNA，转录获得cDNA；

SS2：以步骤SS1所述cDNA为模板，PCR扩增包含T7启动子和鸡传染性支气管炎病毒疫苗株全基因的A、B、C、D四个片段，以基因合成的pUC47-HDVR-T7ter为模板，扩增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7终止子(T7terminator)的片段E；

所述片段A采用引物H120-A-F/R扩增获得；所述片段B采用引物H120-B-F/R扩增获得；所述片段C采用引物H120-C-F/R扩增获得；所述片段D采用引物H120-D-F/R扩增获得；所述片段E采用引物HDV-T7ter-F/R扩增获得；

所述引物序列为：

SS3：将线性质粒pBR322为模板，与步骤SS2中A、B、C、D四个片段分别同源重组，得到分别包含A、B、C、D片段的重组质粒；

SS4：选取步骤SS3所得包含D的重组质粒，将其中部分碱基做同义突变，记为突变片段载体pDt；

SS5：以质粒p15A-cm-ccdB为模板，扩增得到用于感染性克隆组装的线性载体p15A-cm，酶切步骤SS3和SS4中重组质粒，获取A、B、C和Dt片段，将片段A、B、C、Dt、E和线性载体p15A-cm共转入感受态细胞GBdirE.coli中，抗性筛选获得阳性克隆；

SS6：以步骤SS1所得cDNA为模板，扩增得到的N基因再与质粒pVAX1同源重组，构建得到表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N；

SS7：将步骤SS6所述表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N与步骤SS5所得阳性克隆共转染BSR-T7/5细胞，能成功拯救获得鸡传染性支气管炎病毒反向遗传株的阳性克隆即为含有该鸡传染性支气管炎病毒全基因组的感染性克隆；

所述鸡传染性支气管炎病毒疫苗株为H120。

2.一种利用权利要求1所述构建方法得到的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆。

3.一种权利要求2所述鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆在制备载体疫苗中的应用。