[发明专利]一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用，首先是获得覆盖所选冠状病毒全长基因组的cDNA小片段，然后进行分段克隆，再使用RED/ET重组技术将含有冠状病毒全长基因组的cDNA小片段组装到质粒载体上，筛选获得含有该冠状病毒全长cDNA的感染性克隆。其有益效果在于，本发明首次利用中低拷贝的质粒载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆，为冠状病毒的感染性克隆的构建开辟了新途径，该方法解决了冠状病毒载体选择困难和病毒大基因组在细菌中不稳定的问题，阳性克隆率高，且获得的反向遗传疫苗株克隆具有完整性、传代稳定性和感染性，拯救效率高，为研究冠状病毒的致病机理和开发新型疫苗等提供了有效工具。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用。

背景技术

反向遗传学技术是通过构建病毒感染性分子克隆，在DNA水平上进行分子操作，从而研究病毒的结构与功能的方法，由于冠状病毒基因组较大，很难有合适的载体能够容纳如此庞大的基因组来获得病毒。因此冠状病毒基因组的研究一直局限于温度敏感突变株、缺陷病毒以及利用靶向RNA同源重组技术构建的重组病毒，其中靶向RNA同源重组技术是最早用于冠状病毒反向遗传学研究的技术，后来出现了基于痘苗病毒载体和细菌人工染色体(BAC)的冠状病毒反向遗传操作技术，BAC载体具有容量大(理论300kB)，拷贝低(1～2拷贝/E.coli)的特点。目前已报道基于BAC载体构建成功的冠状病毒感染性克隆包括TGEV、SARS-CoV、HCoV-OC43、MERS-CoV和FIPV。然而BAC载体的缺点也是显而易见的，由于拷贝数太低，需要培养大量菌液。BAC提取工作量较大。

对于中低拷贝的质粒载体的冠状病毒感染性克隆，目前还没有构建成功的报道。除了质粒载体容量的原因，最主要原因在于冠状病毒基因组较大并且含有对于E.coli具有毒性的序列，其基因组cDNA克隆在大肠杆菌中不稳定，经常造成一些片段的突变或丢失，并且随着质粒拷贝数的增加，这种不稳定性更加明显。因此限制了中低拷贝的质粒在冠状病毒感染性克隆上的应用。

鸡传染性支气管炎是一种因传染性支气管炎病毒造成的高度接触性、急性及病毒性的呼吸道疾病。临床上的主要症状是打喷嚏、咳嗽及啰音、肾炎、产蛋率及蛋品质下降等症状。且感染不同日龄或者不同种类的家禽引发的影响不同，主要导致呼吸系统、肾脏、生殖系统等方面的疾病的发生，引发的死亡率较高，从而造成很大的经济损失。

传染性支气管炎病毒(IBV)是较为典型的冠状病毒，具有囊膜，是目前已知的RNA病毒中基因组最大的单股正链RNA病毒。该病毒结构蛋白包括核衣壳蛋白，纤突蛋白、小膜蛋白和膜蛋白。由于IBV的RNA聚合酶缺乏校正功能，且纤突蛋白的多变性，并且其基因组复制方式极易发生重组，导致IBV极易发生变异，从而产生新的毒株、基因型或血清型。目前世界范围内报道的IBV毒株至少可以分为30种基因型或血清型。其中Mass型主要包括M14、H52和H120。

鸡传染性支气管炎的防制主要为疫苗接种，传统疫苗在安全性、有效性以及成本等方面都存在一定的缺陷，已经研究的基因工程疫苗中亚单位疫苗免疫效果不如传统疫苗，利用基因工程技术的活载体疫苗在表达外源抗原上具有灵活的可操作性，而且能够有效地传递抗原，但目前作为疫苗活载体只有小RNA病毒，例如，新城疫病毒载体和猪繁殖与呼吸综合征病毒载体。

发明内容

本发明针对于以上问题，提供一种利用中低拷贝的质粒载体构建冠状病毒感染性克隆的方法，克服了现有技术中冠状病毒cDNA在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统方法酶切连接效率低，拯救率低的问题，克服了传统方法不能获得完整全基因组的问题，所述方法包括以下步骤：

S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；

S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法包括酶切或PCR扩增；