[发明专利]一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用

权利要求书

1.一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株已于2019年3月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17424。

2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将上述短小芽孢杆菌接种于种子培养基中，在35～38℃、160～200转/分的条件下，培养14～16小时，制得种子液；

(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比3～5％的比例接种至发酵培养基中，在28～32℃，160～200转/分培养45～50h，制得发酵液；

所述发酵培养基，每升组份如下：

葡萄糖30.0g，K₂HPO₄×3H₂O 7.0g，KH₂PO₄ 3.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.5g，柠檬酸钠·3H₂O0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，pH7.0～7.2，加水定容至1L。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养基为LB肉汤培养基，每升组份如下：

蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母膏5克，水定容至1000毫升。

4.来源于权利要求1所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP的抗菌活性物质，结构式分别如下所示：

化合物II，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲醇：

化合物III，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲酮：

5.来源于短小芽孢杆菌的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(i)将权利要求2中所述发酵液经固液分离，取上清液，经浓缩，制得浓缩液；

(ii)将步骤(ii)制得的浓缩液经乙酸乙酯萃取，取萃取相，浓缩后经硅胶柱层析分离，分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度洗脱，收集具有抗菌活性的石油醚/乙酸乙酯＝50:50洗脱液，浓缩，干燥，制得浓缩干燥物；

(iii)将步骤(ii)制得的浓缩干燥物经高效液相色谱分离，制得抗菌活性物质分别为化合物I、化合物II、化合物III；

所述化合物I，名称为：6,7-(α-羟基)二乙基十二烷：

化合物II，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲醇：

化合物III，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲酮：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)中，固液分离为在3500～4500转/分的条件下离心25～35分钟。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)中，浓缩为采用旋转蒸发，浓缩至原溶液浓度的8～12倍。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，萃取次数为2～4次。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，硅胶柱为200～300目的硅胶柱。