[发明专利]利用双重数字PCR定量检测栗蓉中绿豆成分的方法

权利要求书

1.一种利用双重数字PCR定量检测栗蓉中绿豆成分的方法，其特征在于：采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将绿豆物种特异性基因序列和板栗物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述绿豆物种特异性基因序列和所述板栗物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比，换算得到绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比；

所述方法包括以下步骤：

步骤1.提取栗蓉样品DNA；

步骤2.设计并合成所述板栗物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述绿豆物种特异性基因序列的引物和探针序列；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4.采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

步骤5.根据荧光信号检测结果计算所述绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比，换算得到绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比；

其中，所述绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比

其中a为绿豆特异性基因拷贝数浓度，b为板栗特异性基因拷贝数浓度；

其中，所述绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得；

所述步骤2中，所述板栗物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

板栗特异性基因-F：AAGCCTAAAATGCGACACTACG；

板栗特异性基因-R：TGTCTCCAAGCCCCAACG；

板栗特异性基因-P：FAM-CCTCCACTGCCTTGACGAGGAAGC-BHQ1；

所述步骤2中，所述绿豆物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

绿豆特异性基因-F：GACCGGCAGCTTATGCTTCA；

绿豆特异性基因-R：AACAGCGGCTAACTCGATGTC；

绿豆特异性基因-P：VIC-CAATTAAAGTCGCATGAGAG-MGB。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括将所述栗蓉样品采用试剂盒法提取样品DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双重数字PCR反应包括ddPCR反应和cdPCR反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反应条件为：95℃，5分钟，1℃/秒；94℃，15秒，1℃/秒，60℃，1分钟，1℃/秒，共49个循环；12℃保存反应产物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反应体系为20μL，各组分如下：2×ddPCR^TM预混液10μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.8μL，浓度为10pmol/μL的探针各0.4μL，DNA模板2μL，补水至20μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述cdPCR反应条件为：96℃，10分钟；60℃，2分钟，98℃，30秒，49个循环；60℃，2分钟；10℃保存反应产物。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述cdPCR反应体系为15μL，各组分如下：预混液7.5μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.6μL、浓度为10pmol/μL的探针各0.3μL，DNA模板1.5μL，补水至15μL。