[发明专利]利用双重数字PCR定量检测栗蓉中绿豆成分的方法

说明书

本发明提供了一种利用双重数字PCR定量检测栗蓉中绿豆成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将绿豆物种特异性基因序列和板栗物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述绿豆物种特异性基因序列和所述板栗物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比，换算得到绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比。本方法可准确、快速地为检测出栗蓉中绿豆成分的质量百分比含量，为栗蓉馅料真实性鉴别提供准确可靠的技术数据。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用双重数字PCR定量检测栗蓉中绿豆成分的方法。

背景技术

《GB/T 21270-2007食品馅料》明确规定栗蓉类馅料是以板栗、油、糖为主要原料加工而成的馅料，除油、糖外的馅料原料中板栗含量应不低于60％。由于栗蓉制作工艺简单，市场准入门槛较低，生产企业良莠不齐，部分生产企业为了降低成本，获得更高的利润，向栗蓉中进行掺假。最常见的掺假方法是在栗蓉的生产中掺入绿豆，有的甚至使用板栗香精制作没有板栗的栗蓉。2016年，《南方都市报》报道风靡广州的板栗饼店所售板栗馅饼主要原料为绿豆，利润可高达40％至50％。2015年，《浙江在线》报道杭州“汪记保美”杨家门店的板栗饼不含有板栗成分，而是用绿豆、食用奶粉和面粉勾兑香精而成。这种行为严重妨碍公平贸易，损害消费者的利益，影响食品安全。

目前，《SN/T 4419.9-2016出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法第9部分：栗子》和《DB12/T 843-2018绿豆源成分检测定性PCR法》可以分别对栗子和绿豆进行定性检测，仅能解决栗蓉中是否含有绿豆成分的问题，对栗蓉生产加工过程中由于共用容器、设备和生产线等造成的“无意污染”和以掺假为目的的“有意添加”不能进行有效区分，存在明显的技术局限性，不能满足栗蓉打假的需求。

为保障食品安全，维护公平合法贸易，建立栗蓉中绿豆成分双重数字PCR定量检测方法，可对栗蓉中掺入的绿豆成分进行精准检测，对栗蓉的真伪鉴别提供准确可靠的技术依据。

发明内容

本发明的目的在于针对以上要解决的缺点与不足，提供一种利用双重数字PCR准确、有效地定量检测栗蓉中绿豆成分的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用双重数字PCR定量检测栗蓉中绿豆成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将绿豆物种特异性基因序列和板栗物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述绿豆物种特异性基因序列和所述板栗物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比，换算得到绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比。

优选地，本发明的方法包括以下步骤：

步骤1.提取栗蓉样品DNA；

步骤2.设计并合成所述板栗物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述绿豆物种特异性基因序列的引物和探针序列；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4.采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

步骤5.根据荧光信号检测结果计算所述绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比，换算得到绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比；

其中，所述绿豆占板栗和绿豆的DNA拷贝数百分比其中a为绿豆特异性基因拷贝数浓度，b为板栗特异性基因拷贝数浓度。

其中，所述绿豆成分占板栗和绿豆成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得。

优选地，所述步骤1包括将所述栗蓉样品采用试剂盒法提取样品DNA。