[发明专利]鉴别鸡快慢羽基因型的方法

权利要求书

1.用于鉴别鸡快慢羽基因型的引物对，其特征在于，包括正向引物F和反向引物R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

2.含有权利要求1所述引物对的检测试剂或试剂盒。

3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

i)用于鉴别鸡快慢羽基因型；

ii)用于雏鸡雌雄鉴别。

4.用于鉴别鸡快慢羽基因型的方法，其特征在于，提取待测鸡的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后用BbvCI内切酶对扩增产物进行酶切，根据酶切产物的片段大小判断快慢羽基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因型的判断标准如下：酶切产物出现452bp和499bp两条特征条带，为快羽纯合基因型；酶切产物仅出现951bp一条特征条带，为慢羽纯合基因型；酶切产物出现452bp、499bp和951bp三条特征条带，为慢羽杂合基因型。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测酶切后产物片段的大小。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，电泳检测中琼脂糖凝胶浓度为1.5～2％；电泳条件为：120～150V，20～25min。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Mix10μL，ddH₂O 8μL，10μM正向引物F 0.5μL，10μM反向引物R 0.5μL，DNA 1μL；

其中，2×Taq PCR Mix是2倍浓缩的PCR扩增预混合溶液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液；

PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min，30～35个循环；72℃ 7min；4℃保存。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，酶切反应体系为：2U/μL酶BbvCI 1～2μL，10×Buffer 3μL，PCR扩增产物5μL，ddH₂O 10μL；酶切反应条件为：37℃，2～3h。

10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，基因组DNA的提取方法包括：

1)取5～10μL鸡血于1.5mL离心管中，加入600μL血液裂解液，加入20μL蛋白酶K，混匀；56℃消化过夜；

2)加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心15min；

3)吸取上清至新离心管中，再加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；

4)吸取上清至新离心管中，加入等体积的苯酚-氯仿混合液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；其中，苯酚-氯仿混合液中苯酚、氯仿体积比为1：1；

5)吸取上清至新离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；

6)吸取上清至新离心管中，加入2倍体积冰乙醇，颠倒混匀，出现白色絮状沉淀；4℃，12000rpm离心20min；

7)收沉淀，加入1200μL 75％乙醇，4℃，12000rpm离心1h；

8)收沉淀，挥发乙醇；加入50～100μL水，溶解DNA。