[发明专利]一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法

权利要求书

1.一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获取原始NK细胞：将人胎盘进行清洗和除菌，胎盘组织消化，加入细胞分离液并离心，获取单个的原始NK细胞；

（2）制备培养基：将多孔导电微球与青蒿素复合液按照质量比为1:2-4混合，在50-60℃超声波处理1-3 h，过滤，将负载有青蒿素复合液的多孔导电微球冷冻干燥；加入无血清培养液，在37 ℃下浸泡24-36 h，更换无血清培养液，得到培养基；

（3）激活培养：将所述原始NK细胞加入所述培养基中至NK细胞浓度为3×10⁵-8×10⁵个/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3-15 天，每隔2天换液一次，并调整细胞密度为4×10⁵-6×10⁵个/ml，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增；

（4）细胞收集：培养结束后，一次过滤，得到液体部分和固体部分，向所述液体部分加入缓冲液，1000 g离心力，离心15 min，弃上清液，取第一批NK细胞；向所述固体部分加入洗脱液，反复冲洗，二次过滤，去除固体颗粒部分，1000 g离心力，离心15 min，弃上清液，取第二批NK细胞；将所述第一批NK细胞和第二批NK细胞混合，完成NK细胞收集；

电流进行激活扩增的具体方法为：

（1）第1-2天，电流大小为0.5-1.5 mA，电刺激的频率为36-48次/天，电刺激工作频率为25-30 s/次；

（2）第3-7天，电流大小为2-4 mA，电刺激的频率为100-120次/天，电刺激工作频率为15-20 s/次；

（3）第8-15天，电流大小为5-8 mA，电刺激的频率为150-200次/天，电刺激工作频率为5-10 s/次；

多孔导电微球在所述培养基中的含量为8-20 g/L；

所述多孔导电微球的制备方法包括以下步骤：

S1：以质量百分比计将占反应总体系20 %聚吡咯与25 %N-甲基吡咯烷酮在180℃条件下加热溶解4-6 h得到溶液A；将占总反应体系10 %液态二氧化碳和30 %去离子水在4-10℃，8-10 Mpa的条件下混合，得到溶液B；将所述溶液A加入到所述溶液B中，同时加入占总反应体系12 %乳化剂和3 %分散剂，在4-10℃，8-10 Mpa的环境条件下，以8000-12000 rpm搅拌60-120 min，得到含有实心导电微球的混合液体；

S2：将所述含有实心微球的混合液体升温至35-50℃，减压至0.1-0.3 Mpa，使液态二氧化碳升温气化，得到含有多孔导电微球的混合液体；

S3：对所述含有多孔导电微球的混合液体进行3-5次高压静电脉冲，对所述多孔微球进行冲击破碎，过滤筛分出直径为150-300 μm的多孔导电微球；

S4：将所述多孔导电微球置于真空容器中，抽至真空维持3-6 h，恢复常压10 min，反复进行5-8次，对多孔导电微球内部孔径进行扩撑，，利用无菌水反复冲洗，过滤，冷冻干燥；

S3中所述高压静电脉冲的工艺参数为：电压为55-72 kV，推进速度为110 mm/h，脉宽为12 ms，频率为350 Hz，液面距为10 mm；

所述青蒿素复合液按照重量百分比计包括：2.4-3.6 %谷维素、4.6-5.8 %谷胱甘肽、0.5-1.0 %功能乳化分散剂，余量为青蒿素提取液；

所述无血清培养液在DMEM无血清培养液的基础上添加了多源成分，所述多源成分包括：5-8 g/L碳纳米管、1-5 g/L活性胶原蛋白肽、25-50 mg/L人转铁蛋白、60-80 mg/L亚铁离子、120-250 μg/L神经酰胺、1-2 g/L磷脂、0.1-1 mL/L脂溶性抗氧化剂、2-4 μg/L抗β内啡肽、3-5μg/L纤粘连蛋白、20-60 mg/L维生素E、10-80μM亚油酸、30-55 μg/L表皮生长因子、60-90 mg/L葡萄糖酸钙。

2.如权利要求1所述的一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，所述多孔导电微球的粒径为150-300 μm。

3.如权利要求1所述的一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，所述一次过滤和二次过滤采用孔径为100 μm的滤网。