[发明专利]一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法

说明书

本发明公开了一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，包括在：(1)获取原始NK细胞；(2)利用负载有青蒿素复合液的多孔导电微球与无血清培养液作为培养基；(3)将所述原始NK细胞加入所述培养基中，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增培养；(4)细胞收集。总之，利用本发明的方法可在体外大规模扩增至1000倍以上、纯度大于98％，并且细胞活性高、杀伤力强的人胎盘源NK细胞。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法。

背景技术

目前，癌症已经成为全球第一死亡原因，在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。通常情况常规的治疗手段包括手术、放疗和化疗三种方式。近年来免疫细胞疗法作为第四种治疗肿瘤的新方式，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多。免疫细胞能系统的杀灭肿瘤细胞，进而有效抑制肿瘤细胞的转移，并且副反应小。

NK细胞为免疫细胞中的一种，又称自然杀伤细胞，是人体内一种重要的天然免疫系统淋巴细胞。NK细胞的优势在于其不需抗原致敏和MHC限制就可以识别并杀伤肿瘤细胞，在机体抗肿瘤及早期抗病毒等免疫应答中起着重要作用。因此，NK细胞对肿瘤病人的治疗有很大的前景，但是NK细胞在体内所占的比例低、数量少，限制了NK细胞的应用，所以体外扩增NK细胞技术就开始发展。

目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞，在体外加入因子扩增培养；二是采用饲养细胞的方法扩增原代NK细胞。三是单纯的细胞因子组合刺激NK细胞的扩增。第一种方法需要抽取患者大量的外周血(大于500ml)，才能够达到治疗所需要的细胞数量，并且往往只能扩增几十倍；第二种方法可以获得大量高纯度NK细胞，但容易引来外来细胞系污染。第三种利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高，但扩增倍数和纯度不高且不稳定。除此之外，常规二维培养空间利用率低，细胞所处环境均一性差，导致细胞扩增效率难以提升。因此，寻找一种扩增效率高、细胞纯度高且细胞活性高的人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法很有必要。

发明内容

针对以上以上存在的技术问题，本发明提供一种扩增效率及细胞活性高的人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法。

本发明的技术方案为：一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，包括以下步骤：

(1)获取原始NK细胞：将人胎盘进行清洗和除菌，胎盘组织消化，加入细胞分离液并离心，获取单个的原始NK细胞；

(2)制备培养基：将多孔导电微球与青蒿素复合液按照质量比为1:2-4混合，在50-60℃超声波处理1-3h，过滤，将负载有青蒿素复合液的多孔导电微球冷冻干燥；加入无血清培养液，在37℃下浸泡24-36h，更换无血清培养液，得到培养基；

(3)激活培养：将原始NK细胞加入培养基中至NK细胞浓度为3×10⁵-8×10⁵个/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3-15天，每隔2天换液一次，并调整细胞密度为4×10⁵-6×10⁵个/ml，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增；

(4)细胞收集：培养结束后，一次过滤，得到液体部分和固体部分，向液体部分加入缓冲液，1000g离心力，离心15min，弃上清液，取第一批NK细胞；向固体部分加入洗脱液，反复冲洗，二次过滤，去除固体颗粒部分，1000g离心力，离心15min，弃上清液，取第二批NK细胞；将第一批NK细胞和第二批NK细胞混合，完成NK细胞收集。

进一步地，多孔导电微球的粒径为150-300μm。