[发明专利]抗肿瘤NK细胞的制备方法及其细胞与应用

说明书

本发明公开一种转基因NK细胞的制备方法，步骤：(a)将趋化因子受体基因CCR7基因和CXCR4基因连接到慢病毒载体PHS‑BVC‑LW238，形成重组基因工程载体；(b)将重组基因工程载体转染所述NK92细胞，得到转基因NK细胞。该转基因NK细胞能够良好地抑制肿瘤的生长。

技术领域

本发明属于医学领域，涉及瘤体趋化的新型高效抗肿瘤NK细胞及其研制。

背景技术

近年来，免疫治疗在肿瘤治疗领域中的应用越来越广，2014、2015年连续两年被评为年度最重要的科学突破领域，其成就超越了传统化疗、放疗和手术，成为癌症治疗的新手段。包括DC、CAR-T、NK细胞和免疫检查点单抗等的肿瘤免疫治疗研究越来越深入。

目前认为，细胞免疫治疗针对实体肿瘤的疗效的制约瓶颈有三：肿瘤缺乏理想的靶点、瘤体组织浸润的活化免疫细胞少和肿瘤微环境免疫抑制。NK细胞具有强大的天然抗肿瘤和抗感染免疫作用，其抗肿瘤活性无需肿瘤细胞抗原(靶点)即可识别并攻击肿瘤细胞，回避了实体肿瘤细胞缺乏理想的靶点这一障碍。

NK细胞具有抗肿瘤、抗感染和调节机体免疫应答等功能，NK细胞不需要特异抗原的刺激，在免疫治疗领域有较好的前景。早期利用NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)进行免疫治疗。

肿瘤细胞已进化出多种机制来逃避NK细胞识别，其中包括MHCI类分子和NK抑制性受体配体的表达。为了克服肿瘤细胞对NK细胞介导的溶解性的抵抗，提高对肿瘤识别能力，嵌合受体被广泛研究。其原理：引入嵌合抗原受体将极大避免将抑制性信号传递到NK细胞内，从而增强NK细胞抗肿瘤能力。目前，常用基因修饰的方法使NK细胞表达肿瘤相关抗原(TAA)特异性的嵌合受体，一旦接触抗原，嵌合受体信号即可激活NK细胞。嵌合受体必须引入信号转导结构域才能有效增强NK细胞功能，包括细胞毒作用和细胞因子的释放，最常用的是来自TCR-CD3复合物的信号结构域。

近年来，NK细胞因其独特优势和作用机制作为针对肿瘤的免疫治疗越来越受到重视[1]，并成为治疗癌症的新型有效手段。NK细胞在循环中的相对较短的寿命避免了许多基于T细胞的免疫疗法中常见的危险细胞因子风暴[2]，因而过继输注NK细胞的脱靶毒性很小。NK细胞的独特优点是它们可以在没有特异性抗原识别的情况下杀死肿瘤细胞，已在多种肿瘤治疗上取得一定的效果，如血液肿瘤和黑色素瘤等[3-5]。并且NK细胞的过继输注已成功应用于白血病和其他血液肿瘤患者[6-8]。然而，其在包括结肠癌在内的其他实体瘤中的治疗效果并不理想[9,10]。多项研究报道影响NK细胞过继免疫治疗成败的关键在于迁移到肿瘤部位的NK细胞数量[9,2,1,6]。目前针对NK细胞肿瘤杀伤的研究主要集中在促进其在体内生存、体内平衡增殖等方面；而促进NK细胞趋化、聚集到肿瘤部位是非常重要的一个环节，目前尚未见研究报道。这种研究是临床NK细胞免疫治疗新兴的重要方向[2,11]。

最近的研究表明，细胞因子激活和体外扩增的NK细胞缺乏或表达低水平的趋化因子受体，这意味着NK细胞上趋化因子受体的表达量可能对NK细胞向瘤体趋化这一过程至关重要。

趋化因子和趋化因子受体在淋巴细胞向肿瘤迁移中起着重要作用[12]。将NK细胞有效运输到肿瘤部位是癌症免疫治疗成功的关键步骤。通过对NK细胞免疫治疗进行临床I期试验，Childs RW等发现一种影响实体瘤患者NK细胞输注临床结果的重要制约因素是NK细胞未能足量迁移至肿瘤部位[13]。免疫细胞可以通过细胞表面的趋化因子受体与肿瘤分泌的趋化因子相互作用被引导进入肿瘤[12]。近年来这些特征在肿瘤免疫治疗种得到越来越多的关注。先前已有给予外源性细胞因子，或通过转基因提高趋化因子表达水平，从而促进NK细胞增殖而提高瘤体内NK细胞数量的报道[13]，这种方案的缺点是外源性细胞因子的全身副作用大，难以控制细胞因子表达量，直接作用于NK细胞的浓度也不高。此外，细胞因子转基因修饰方式受到主要组织相容性复合基因MHC分子限制性的控制，使得其应用亦受到限制。而通过基因修饰NK细胞表面的趋化因子受体，既可以避免转基因修饰细胞因子不足，又可以使免疫细胞更多的向肿瘤微环境浸润，增强抑瘤作用。