[发明专利]利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法

权利要求书

1.利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、PCR扩增ccdB基因表达盒子、表达载体和目的基因，得到含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物、含线性表达载体的PCR产物和含线性目的基因的PCR产物；所用到的引物为：(1)ccdB基因表达盒子的扩增引物ccdB-HF和ccdB-HR；(2)载体扩增引物HF和HR；(3)扩增目的基因的引物gene-HF和gene-HR；

b、将步骤a得到的含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物与含线性表达载体的PCR产物混合后转入耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素A和抗生素B的培养基中培养，线性ccdB基因表达盒子与线性表达载体发生同源重组，得到带ccdB基因表达盒子的环状载体；抗生素A和抗生素B不同；

c、使用载体扩增引物扩增步骤b得到的带ccdB基因表达盒子的环状载体，得到含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物；

d、将步骤a得到的含线性目的基因的PCR产物与步骤c得到的含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物混合后转入不耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素B的培养基中培养，线性目的基因与删除ccdB基因表达盒子的线性载体同源重组，得带有目的基因的环状载体；

步骤a所述的ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；

步骤a中ccdB基因表达盒子的扩增引物序列以及扩增目的基因的引物序列均包括2个片段：(I)能够扩增ccdB基因表达盒子或目的基因的片段，(II)能够与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；

所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段。

2.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：所述片段(II)的长度为18nt。

3.根据权利要求3所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的全部片段。

4.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：步骤b中所述感受态细胞为大肠杆菌DB3.1的感受态细胞。

5.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：所述抗生素A是氯霉素。

6.根据权利要求5所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：所述ccdB基因表达盒子DNA序列如SEQ ID NO：14所示。

7.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：步骤a所述的表达载体的数量为2个以上，表达载体携带一段36bp以上的固定序列，该固定序列能被引物HF和HR匹配扩增出载体的全长。

8.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：步骤d所述感受态细胞为大肠杆菌菌株DH5α的感受态细胞。

9.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：步骤d中，“步骤a得到的含线性目的基因的PCR产物”与“步骤c得到的含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物”的摩尔比为2∶1。

10.根据权利要求1所述的利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于：还包括步骤e：挑选单克隆菌落进行菌液PCR验证，提取质粒并测序鉴定，得到含有相同基因的不同功能用途的重组表达质粒。