[发明专利]利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法。本发明使用PCR和菌体内同源重组的机制相结合，摆脱了载体构建中对DNA酶切和连接的依赖；引入ccdB致死基因，简化了阳性克隆的筛选。本发明可用于高通量的载体构建，具有省时、省力、低成本的优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法。

背景技术

质粒是现代生物学研究的基本工具，已经应用到生命科学研究与医疗健康发展的各个方面，如文库建立、蛋白表达、基因治疗、基因编辑和DNA疫苗等方方面面。分子克隆技术是将扩增的目的DNA片段插入到目的质粒载体的过程，是现代生物医学研究的核心技术之一，质粒构建几乎成为所有生物医学基础研究的首要工作。随着第三代基因测序技术的推广，大量数字化基因信息需要转化为生物医学基础研究所必须的各种重组质粒。快速建立单个基因的多用途载体库，成为了很多研究者的迫切需求。

传统分子克隆技术依赖多种生物工程酶，且需要体外连接反应，并存在菌落验证假阳性的问题，其工作流程繁琐、复杂、费时、费力，已经不适应现代生物医学基础研究的需求。

借助同源重组的方法能够避免传统分子克隆技术所依赖的核酸内切酶和连接酶。其基本原理是，通过带有同源序列的2对引物分别PCR扩增质粒载体和目的基因，分别带有线性质粒载体和线性目的基因的PCR产物(其中线性质粒载体和线性目的基因带有同源序列，该同源序列是由PCR引物引入的)，再将前述2种PCR产物同时转入到感受态细胞内，使其中的线性质粒载体与线性目的基因发生同源重组，再通过抗生素筛选(质粒载体中带有该抗生素的抗性基因)，即可得到阳性重组载体。但是，该方法具有假阳性的缺点：PCR产物中仍然带有一部分未扩增的环状空载体，环状空载体与线性目的基因不会发生重组，带有该环状空载体的感受态细胞仍然可以在抗生素筛选下形成克隆，因而产生了假阳性。

发明内容

为了杜绝重组质粒构建的过程中，空载体导致的假阳性，本发明提供了以下技术方案：

利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，包括以下步骤：

a、PCR扩增ccdB基因表达盒子、表达载体和目的基因，得到含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物、含线性表达载体的PCR产物和含线性目的基因的PCR产物；所用到的引物为：(1)ccdB基因表达盒子的扩增引物ccdB-HF和ccdB-HR；(2)载体扩增引物HF和HR；(3)扩增目的基因的引物gene-HF和gene-HR；

b、将步骤a得到的含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物与含线性表达载体的PCR产物混合后转入耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素A和抗生素B的培养基中培养，线性ccdB基因表达盒子与线性表达载体发生同源重组，得到带ccdB基因表达盒子的环状载体；抗生素A和抗生素B不同；

c、使用载体扩增引物扩增步骤b得到的带ccdB基因表达盒子的环状载体，得到含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物；

d、将步骤a得到的含线性目的基因的PCR产物与步骤c得到的含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物混合后转入不耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素B的培养基中培养，线性目的基因与删除ccdB基因表达盒子的线性载体同源重组，得带有目的基因的环状载体；

步骤a所述的ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；

步骤a中ccdB基因表达盒子的扩增引物序列以及扩增目的基因的引物序列均包括2个片段：(I)能够扩增ccdB基因表达盒子或目的基因的片段，(II)能够与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；

所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段。