[发明专利]一种N-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用

说明书

本发明公开了一种N‑乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用，属于遗传工程领域。本发明以来源于大肠杆菌(Escherichia coli K 12)的转录调控因子NanR，GFP基因为报告基因构建了N‑乙酰神经氨酸特异性的生物传感器，并建立了N‑乙酰神经氨酸与荧光强度的有效关系。该生物反应器在筛选产目的代谢产物的微生物方面具有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种N-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是生物体内的一种单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸是细胞信息传递的第一接触位点，参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于调节IgG抗炎活性，增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从酪蛋白、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品容易引起过敏反应，或是通过严苛条件的化学法合成，高温、高压工艺复杂，中间产物等难以分离，而且对环境污染严重。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级N-乙酰神经氨酸的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径调控严密，并不会形成氨糖的积累，而且没有N-乙酰神经氨酸关键基因。如何改造枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径，供需前体物质，以及建立N-乙酰神经氨酸代谢途径是首先需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是提供一种生物传感器，含有启动子P_rapH、P_hbs，NanR基因、NanR基因结合位点和编码标记物的基因；所述P_rapH调控NanR的表达；所述P_hbs上整合调控NanR基因结合位点的序列，并调控编码标记物的基因表达；所述启动子P_rapH和启动子P_hbs转录方向相反。

在本发明的一种实施方式中，启动子P_rapH、P_hbs、NanR基因和NanR基因结合位点位于载体上。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pHT01。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物为荧光蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物为绿色荧光蛋白。

在本发明的一种实施方式中，编码所述启动子P_rapH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述启动子P_hbs的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述NanR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述NanR结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述生物传感器的基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，含有上述所述的生物传感器，并表达念珠藻来源的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和大肠杆菌来源的N-乙酰神经氨酸合酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以木糖诱导型启动子P_xylA诱导N-乙酰神经氨酸的积累、

在本发明的一种实施方式中，所述念珠藻为念珠藻(Anabaena sp.)CH1。