[发明专利]一株产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一株产聚唾液酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号K235‑GX124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018878，保藏日期为2018年12月10日。本发明还公开了上述高产聚唾液酸的菌株的筛选方法和发酵工艺，属于生物工程技术领域。本发明建立了一种高效制备聚唾液酸的发酵工艺，发酵过程中当聚唾液酸浓度达到一定程度，离心回收菌体，通过陶瓷膜截留聚唾液酸实现产物分离，滤液与菌体混匀继续发酵，经7个批次连续发酵，唾液酸总产量达48.1g/L。本发酵技术不借助任何络合剂或通透剂，通过陶瓷膜截留聚唾液酸，降低产物抑制，大幅度提升了聚唾液酸产量。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种聚唾液酸高产菌株的获得方法以及聚唾液酸的发酵工艺。

背景技术

唾液酸(SA)，学名叫作“N-乙酰基神经氨酸”，是一种天然存在的碳水化合物。它最初由颌下腺粘蛋白中分离而出，也因此而得名。唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在。在人体中，脑部的唾液酸含量最高，其唾液酸含量是肝、肺等内脏器官的15倍。在医学领域中，称做神经节苷脂，它在大脑和神经系统的产生和发育中发挥非常重要的作用。同时，动物实验研究表明，动物学习能力底下与神经节苷脂含量水平正相关，补充营养可以提高神经节苷脂水平。特别是对于出生体重较低的婴儿，充足的唾液酸补给对婴儿的大脑正常发育至关重要。而母乳是婴儿获取唾液酸的主要食物来源。而女人分娩后体内的唾液酸含量水平逐渐下降，为维持体内唾液酸水平，孕妇乃至孕后需额外摄取足量的唾液酸。另外，唾液酸的含量还与DHA的含量有着明显的相关性，这表明它极有可能与婴儿的脑结构和脑功能发育有关，可能两者都对早期脑发育有益。

聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细胞的表面。在固体发酵过程中,聚唾液酸通常以夹膜的形式附于细胞表面；在液体发酵过程中,由于搅拌等作用聚唾液酸通常以粘液的形式脱落到发酵液中。将聚唾液酸进行酸水解或酶水解后,分离纯化可得到唾液酸,这是工业化发酵生产唾液酸的基础。

现阶段的聚唾液酸生产菌株主要是大肠杆菌，野生型大肠杆菌聚唾液酸的产量一般都不高且发酵水平不稳定,极易发生负向的自发突变。通过诱变筛选，往往可以得到稳定高产的生产菌株。

日前，聚唾液酸在医药、食品添加剂和化妆品领域受到热捧，市场前景广阔。目前，工业化方法发酵生产普遍产量低下，在5-6g/L左右，其中武汉中科光谷通过在发酵液中添加对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力的分离剂，使得唾液酸的产量达到30g/L以上，但由于使用的分离剂具有一定的毒性，一定程度上限制了其应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株经高产聚唾液酸的大肠杆菌，以解决现有技术中聚唾液酸产量低、发酵水平不稳定的问题。

本发明还要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌在发酵生产聚唾液酸或唾液酸方面的应用。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一株产聚唾液酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌Escherichia coli)，菌株号K235-GX124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018878，保藏日期为2018年12月10日。

本发明的大肠杆菌Escherichia coli K235-GX124的筛选方法，将大肠杆菌出发菌株K235(购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC))经等离子体诱变后，利用初筛得到能够产聚唾液酸的菌株，再经过复筛得到高产聚唾液酸的菌株。

其具体步骤如下：

(1)制作种子液：将活化好的大肠杆菌菌种接种LB培养基上，培养温度37℃，当培养4-6小时是对数期，本试验采用对数期培养5小时的大肠杆菌，将对数期的大肠杆菌用0.8％生理盐水调其浓度，通过梯度稀释稀释10⁴-10⁵倍；