[发明专利]一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法

权利要求书

1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：

（1）对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用；所述近距离为距离50埃以内；

（2）在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔；

（3）降解游离的不受蛋白质保护的RNA；

（4）在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接；所述近端为距离50埃以内；所述“pCp-标记物1”为两端为磷酸基团且标记有标记物1的胞嘧啶核苷酸；

所述步骤（4）是按照包括如下步骤的方法进行的：

（d1）将所述受蛋白质保护的RNA的3’末端羟基化；

（d2）将RNA的3’末端标记为“Cp-标记物1”，具体通过向步骤（d1）处理过的样本中加入所述“pCp-标记物1”，进行连接反应，从而实现将RNA的3’末端标记为所述“Cp-标记物1”；所述“Cp-标记物1”为3’末端为磷酸基团且标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸；

（d3）将RNA的3’末端的所述“Cp-标记物1”中的磷酸基团转变为羟基；

（d4）将RNA的5’末端磷酸化；

（d5）在原位进行所述近端连接，具体通过向步骤（d4）处理过的样本中加入T4 RNA连接酶，从而实现在原位进行所述近端连接；

（5）细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA；进行链特异性文库构建；所述“C-标记物1”为标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸；所述细胞消解为使用蛋白酶K对细胞进行处理；所述含有“C-标记物1”的嵌合体RNA为标记有所述“C-标记物1”的RNA片段与受蛋白质保护的RNA经过所述近端连接后形成的嵌合体RNA；

（6）进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述对细胞或组织样本进行处理为对细胞或组织样本进行甲醛交联。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）是按照包括如下步骤的方法进行的：

（a1）将所述细胞或组织样本置于甲醛溶液中，室温放置10分钟。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述甲醛溶液为体积百分比为1%的甲醛溶液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤（a1）之后还包括如下步骤（a2）：

（a2）向步骤（a1）处理过的细胞或组织样本中加入甘氨酸溶液，放置10分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述甘氨酸溶液为浓度为0.125 mol/L的甘氨酸溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，进行所述膜穿孔时采用的穿孔液的溶剂为10 mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度如下：10 mM NaCl，0.5% NP-40，0.3% Triton X-100，0.1 % Tween 20，1×蛋白酶抑制剂和2 U/ml RNA酶抑制剂；%均表示体积百分含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）是按照包括如下步骤的方法进行的：

（b1）将经步骤（1）处理过的细胞或组织样本置于所述穿孔液中， 0-4℃放置15分钟。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在步骤（b1）之后还包括如下步骤（b2）：

（b2）将步骤（b1）处理过的细胞或组织样本用1×PNK 溶液洗涤；其中，所述1×PNK 溶液的溶剂为50 mM pH 7.4的Tris-Cl缓冲液，溶剂及浓度如下：10 mM MgCl₂，0.1 mg/mlBSA，0.2% NP-40；%表示体积百分含量。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，是采用微球菌核酸酶来实现所述“降解游离的不受蛋白质保护的RNA”的。