[发明专利]一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法

说明书

本发明公开了一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。该方法包括：固定细胞或组织中蛋白质介导的RNA相互作用；在保持细胞完整的情况下行膜穿孔；降解游离RNA；在RNA3’末端行pCp‑biotin标记并原位近端连接；细胞消解后纯化含C‑biotin的嵌合体RNA；构建链特异性文库；高通量测序。本发明在不破坏细胞结构、保持细胞完整的情况下，原位处理胞内RNA，捕获生理状态下RNA分子内(间)相互作用；用pCp‑biotin标记RNA末端，非变性条件下原位连接，极大提高标记效率，同时降低分子间非特异连接；用C1磁珠能高效富集标记C‑biotin的嵌合体RNA，增加测序有效数据比例，降低测序成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。

背景技术

遗传信息的载体DNA需要先转录成RNA，然后再翻译成蛋白质才能发挥生物学功能。RNA作为遗传信息的传递者，主要作用是编码和指导蛋白质的合成，这一类编码蛋白质的RNA统称为信使RNA(messenger RNA,mRNA)。此外，人类基因组还转录产生了海量的不编码蛋白质的RNA，这类RNA被称为非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)。目前已发现的具有调控作用的非编码RNA包括：tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、circRNA和lncRNA等，它们的异常表达和突变与癌症发生、发育和生殖缺陷等重大疾病相关。作为遗传信息的关键调控者，RNA往往需要先通过分子内碱基配对形成复杂的高级结构，然后再通过与其他的RNA分子相互作用才能发挥重要的生物学调控功能。利用测序技术，我们已经可以获得RNA的详细序列信息，但是对于RNA的结构，尤其是高级结构信息的获取依然是个世界性难题。虽然一些物理手段，比如核磁共振、冷冻电镜和晶体学等方法可以解析RNA的高分辨率结构和分子内及分子间相互作用，但是这些技术的通量太低。目前国际蛋白质数据库PDB中收录的人源RNA的高分辨率结构屈指可数。因此，如何系统和精确的解析RNA的分子内和分子间相互作用依然是我们所面临的巨大挑战。

近年来，大量分析RNA二级结构的技术被开发出来，这些技术的特点是先利用化学修饰或者酶切处理RNA，然后再进行建库测序，例如：DMS-seq、Structure-seq、icSHAPE等，他们利用了单链区的RNA容易被化合物DMS(dimethyl suberimidate，硫酸二甲酯)或NAI-N3等修饰的特点，通过分析反转录酶停止的位置而推导RNA的哪些碱基处于单链区。此外，对于RNA结构中的双链配对区域，目前也有多个方法可以解析，例如PARIS、LIGR-seq和SPLASH等。这三种方法的基本原理是：在培养基中加入Psoralen或AMT，它们进入细胞后会穿过细胞膜并迅速结合到RNA上双链配对的区域，经254nm的紫外线(UV)照射后，细胞内配对的RNA会被psoralen或AMT共价交联起来，之后对富集出的RNA进行片段化处理，并在溶液中进行近端连接。然后对连接后的RNA进行365nm UV照射后可打开psoralen或AMT与双链RNA之间的共价键，之后进行文库构建和测序。以上方法虽然可以高通量的研究RNA的单链区和双链区，但也存在一些缺陷：第一，不能捕获非Watson-Crick配对以及远距离的RNAloop-loop相互作用。第二，这些连接反应都是在溶液中进行，存在非特异性连接，不能反映RNA在细胞内的真实结构，导致大量的假阳性分子间连接。第三，测序所得数据中，嵌合体reads(chimeric reads,即不同RNA片段间连接的产物)比率较低，无用数据太多。RNA近端连接技术(RPL)理论上可以克服以上技术缺陷，但由于缺乏交联和嵌合体RNA富集，因此导致RPL技术只能鉴定分子内相互作用，而不能鉴定分子间的RNA-RNA相互作用。