[发明专利]一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法

说明书

本发明公开了一种增强产甘油假丝酵母2‑苯乙醇耐受性的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过在产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)中过表达了来源于自身的麦角固醇合成途径中的C‑24(28)还原酶基因erg4，获得重组菌株Cgerg4。与空载对照菌株相比，重组菌株在高浓度2‑苯乙醇(3.5g/L)的外界环境下具有较明显的生长优势，其菌体干重提高了103％。且在发酵培养基中，重组菌株的菌体干重及2‑苯乙醇的产量得到增强，分别提高了12％和16％，2‑苯乙醇产量达到3.89g/L。

技术领域

本发明涉及一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

2-苯乙醇(2-PE)是一种具有玫瑰香气的高级醇，是化妆品、食品、香精的重要原料。化学合成的2-苯乙醇因含致癌物质(苯乙烯等)已被禁止在化妆品、食品等领域使用。植物萃取法获得的天然2-苯乙醇，其原材料(玫瑰花等)供应价格昂贵且产量无法满足市场供应。基于发酵法生产天然2-苯乙醇具有广阔的应用前景。然而，2-苯乙醇会对菌株产生高毒性，降低了2-苯乙醇的产量。

为解决这一瓶颈，研究者多采用两种解决方案：1.采用原位萃取技术，降低发酵液中2-苯乙醇浓度进而减弱产物对细胞生理代谢的抑制功能，提高产物的合成速率。然而由于萃取剂的加入，增加了下游产物分离的难度及成本，另外萃取剂难以清除干净严重影响了产品的质量。2.诱变获得高耐受菌株，但此方法效率低，周期长。因此，利用基因工程手段获得耐高浓度2-PE的菌株对于提高2-苯乙醇的产量具有重大意义。

麦角固醇是一种真菌细胞膜的重要组成成分，不仅可以维持细胞膜的完整性，同时参与维持细胞膜的流动性、维持膜蛋白的活性、信号分子的传递等多种生物学活动。另外，麦角固醇在抵御外界环境(低温、氧化、乙醇等)压力也发挥了重要作用(Hu,Z.,He,B.,Ma,L.,Sun,Y.,Niu,Y.,and Zeng,B.(2017).Recent Advances in ErgosterolBiosynthesis and Regulation Mechanisms in Saccharomyces cerevisiae[J].Indianjournal of microbiology57,270-277)。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018(已在公开号为CN105713933B的专利中公开)是一株具有优良发酵性能的工业菌株，具有高效的2-苯乙醇合成能力，及较完整的基因改造工具，为进一步分子改造菌株提高2-苯乙醇的耐受性及产量提供了有利的基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产甘油假丝酵母工程菌，是以pGAPa为载体，过表达C-24(28)还原酶基因，所述C-24(28)还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCC M 93018。

在本发明的一种实施方式中，编码所述C-24(28)还原酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述产甘油假丝酵母工程菌的方法，包括以下步骤：

(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，PCR扩增erg4基因；

(2)将erg4基因插入到产甘油假丝酵母过表达重组质粒pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达整合载体pGAPa-erg4；

(3)将pGAPa-erg4转化至产甘油假丝酵母中。

在本发明的一种实施方式中，所述转化是通过醋酸锂转化法进行的。