[发明专利]耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因片段，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PCR扩增所使用的上下游引物分别为：

上游引物FaeLcr-F 5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′

下游引物FaeLcr-R 5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′；

步骤2：将所得阿魏酸酯酶基因片段经NdeI和XhoI双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接，构建得到重组表达载体pET-FaeLcr；将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；

步骤3：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。

2.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，卷曲乳杆菌的DNA获得方法为：取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1ml，6000rpm,4℃离心3min收集菌体，重悬于567μl TE缓冲液，所述TE缓冲液pH 8.0由10mM Tris-HCl和1mM EDTA配置而成，添加25μL 50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h；加入30μL质量百分比10％SDS、3μL20mg/ml的蛋白酶K，65℃条件下水浴1h，再加入预冷的氯仿3mL，混匀后离心收集上清；加入等体积预冷的体积比为25：24：1的苯酚：氯仿：异戊醇混合溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的体积比为24：1的氯仿：异戊醇，再次离心，取上层水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀；最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，取40μL TE缓冲液溶解沉淀，即得卷曲乳杆菌DNA。

3.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，10μM的上下游引物各2μL，DNA模板1μL,加 ddH₂O至50μL；

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，酶切条件为37℃，3h，酶切体系为：NdeI 5μL，XhoI 5μL，10×K Buffer 10μL，0.1％BSA 10μL，阿魏酸酯酶DNA/pET-22b(+)质粒DNA5μg，无菌水补足至100μL；将经过双酶切的阿魏酸酯酶DNA片段和pET-22b(+)载体DNA按照10:1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜连接；将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h；150rpm将菌液离心去掉上清液800μL，用剩余的菌液重悬菌体，涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板；转化，得到重组大肠杆菌。

5.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，37℃过夜培养，取菌液，以1％-2％接种量加入到100mL的LB液体培养基中，37℃培养，生长至菌液OD为0.5-0.8时，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，继续诱导发酵16-24h；将诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，去除菌体，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，即得阿魏酸酯酶。

6.根据权利要求1-5任一所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。