[发明专利]耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。本发明制备的阿魏酸酯酶的最适反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领域中具有应用潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用。

背景技术

阿魏酸酯酶是一类能够降解植物细胞壁中阿魏酸与木质素及阿拉伯半糖相交联的酯键的水解酶。根据阿魏酸酯酶催化底物的专一性和其蛋白质序列特异性，可以把阿魏酸酯酶分为A、B、C、D四类。利用阿魏酸酯酶，可以降低生产工艺中采用化学法所带来的环境问题，因此在造纸、纺织、饲料、食品等轻工行业具有广泛应用前景。阿魏酸酯酶作用底物产生的阿魏酸作为一种天然抗氧化剂，在食品、保健品和化妆品的应用中具有巨大潜力。

微生物阿魏酸酯酶的性质具有多样性，来源不同的微生物具有各自不同的物理化学性质及生物学特点。微生物产生的阿魏酸酯酶分子量大小范围很大，目前已知最小的为Neocallimastix MC-2所产生的11kDa大小的阿魏酸酯酶，最大的为Aureobasidiumpullulans所产210kDa的阿魏酸酯酶，但是大部分都集中在30kDa-70kDa范围之内。由于结构的差异性，不同的微生物阿魏酸酯酶对各种底物的亲和性也不相同。不同来源的阿魏酸酯酶催化底物的最适pH值范围一般为4.0-8.0，最适温度一般为30℃-55℃。

中国专利一种酯酶及其应用(申请号201610086094.8)公开了一种来源于约氏乳杆菌的酯酶，该酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH为6。专利一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌(申请号201810545554.8)公开了一种从青贮饲料分离得到的可以产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，其中阿魏酸酯酶的最适pH为6.4、最适温度37℃。

早期开发的阿魏酸酯酶最适pH值大多在酸性范围内,但是具有耐碱性或具有耐热性的新型阿魏酸酯酶具有更广阔的应用前景。以造纸行业为例，由于纸浆漂白时必须调节浆料pH值,给操作带来不便。为了适应碱法制浆的碱性高温条件,获得耐碱耐高温的新一代阿魏酸酯酶产品就变得十分重要，这样的酶用于纸浆漂白时无需调节浆料的pH值和温度。因此,从微生物中筛选、分离并鉴定,或者通过基因工程和蛋白质工程等手段获得耐热耐碱性阿魏酸酯酶，是目前该领域的研究热点。

发明内容

为解决现有阿魏酸酯酶的最适反应温度及pH值较低，本发明的目的在于提供一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

本发明提供一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：

步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，纯化，制备得到阿魏酸酯酶。

进一步的，所述步骤1中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括：

(1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因，PCR扩增所使用的上下游引物分别为：

上游引物FaeLcr-F5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′

下游引物FaeLcr-R5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′；