[发明专利]基于6B琼脂糖微球的纯化亲和素介质的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于6B琼脂糖微球的纯化亲和素介质的制备方法，包括如下步骤：1)通过溴化氰对6B琼脂糖微球活化，得到活化后的琼脂糖微球；2)将活化后的琼脂糖微球与对氨基化合物进行偶联反应，得到氨基修饰的琼脂糖微球；3)将氨基修饰的琼脂糖微球与能特异性结合亲和素的氨基生物素在偶联剂作用下偶联反应；4)反应结束后，加入PBS溶液冲洗，即得纯化亲和素介质。该发明采用稳定的对氨基化合物对溴化氰活化的6B琼脂糖表面进行氨基化修饰，提高了产物的化学稳定性和耐受性，扩展了琼脂糖微球的运用范围；同时采用在弱酸性环境下可充分解离的氨基生物素作特异性结合亲和素的配基，提高了亲和素的纯度和纯化效率。

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种基于6B琼脂糖微球的纯化亲和素介质的制备方法及其应用。

背景技术

随着现代生物医药产业的高速发展，要求生物材料的性能逐步提高；其中，以琼脂糖制备的纯化亲和素介质广泛运用于蛋白质的分离工程中，介质性能直接决定了分离纯化的效率。

琼脂糖作为一种富含有羟基，特别是溴化氰活化羟基后的琼脂糖微球，具有高效结合蛋白或者氨基物质的能力，是亲和纯化过程中，运用最广泛的基质合成材料。但由于普通溴化氰活化的琼脂糖微球只能结合氨基或者巯基类的物质，而有些配基不含有氨基和巯基，无法直接和微球进行连接，而常用的方法是先将配基偶联到载体蛋白上，比如BSA，合成修饰的蛋白，再进行透析，去除未耦合的化物物质，然后将修饰后的蛋白通过其氨基偶联到活化的琼脂糖微球上。然而，此方法引入了蛋白，但蛋白本身不稳定，在纯化的过程中蛋白容易降解，掉落配基，同时掉落的蛋白会污染被纯化的物质。

另外，生物素虽然能与亲和素特异性结合，但其结合能力极强，一旦结合后难以被分离，除非在强变性剂的条件下解离，但亲和素的活性完全被破坏。

发明内容

本发明的目的是克服现有亲和素不易纯化，且纯度和纯化效率低的问题。

为此，本发明提供了一种基于6B琼脂糖微球的纯化亲和素介质的制备方法，包括如下步骤：

1)通过溴化氰对6B琼脂糖微球活化，得到活化后的琼脂糖微球；

2)将活化后的琼脂糖微球与对氨基化合物进行偶联反应，得到氨基修饰的琼脂糖微球；

3)将氨基修饰的琼脂糖微球与能特异性结合亲和素的氨基生物素在偶联剂作用下偶联反应；

4)步骤3)反应结束后，加入PBS和NaN₃，即得纯化亲和素介质。

进一步的，所述步骤1)6B琼脂糖微球活化过程中，溴化氰与6B琼脂糖微球的质量比为0.01～1:1，反应温度为20～37℃，反应时间为30～120min。

进一步的，所述溴化氰与6B琼脂糖微球在0.1～1mol/L的碳酸钠缓冲液中进行混合。

进一步的，所述步骤2)偶联反应中，活化后的琼脂糖微球与对氨基化合物的质量比为1：0.05～1，反应温度为20～60℃，反应时间为30～120min。

进一步的，所述对氨基化合物为尿素、乙二胺、丁二胺、乙二胺、辛二胺、二氨基癸烷或二氨基十二烷。

进一步的，所述步骤2)偶联反应的对氨基化合物溶于PBS缓冲液中。

进一步的，所述步骤3)中氨基生物素为二亚氨基生物素，偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，且二亚氨基生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和氨基修饰的琼脂糖微球的质量比为0.1～5:0.2～4:1～20，反应温度为20～37℃，反应时间为1～4h。