[发明专利]一种抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将西番莲果肉与水混合，水磨磨细后加入复合蛋白酶与酶解助剂酶解，灭酶得酶解液；

2)将步骤1)中的酶解液中的固液分离，取液相超滤，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物；

3)以水复溶步骤2)的浓缩提取物，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到西番莲抗氧化肽粗品；

4)西番莲抗氧化肽粗品经二次纯化即得抗氧化肽纯品；

其中，所述复合酶是重量比为1:0.3～1.5的丝氨酸蛋白酶Carsberg和胰蛋白酶YDB-CF的混合酶；

所述酶解助剂是含有0.1～1wt％戊二醇和0.8wt‰t-亮氨酸叔丁酯的水溶液。

2.根据权利要求1所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述复合酶的添加量是西番莲果肉重量的3～11％；所述酶解助剂的添加量是复合酶添加量的1/5～1重量倍。

3.根据权利要求1或2所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述酶解温度为48～52℃，所述酶解时间为25～60min。

4.根据权利要求1或2所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述凝胶层析柱的洗脱溶剂为超纯水，所述洗脱溶剂的流速为1mL/min。。

5.根据权利要求1所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述二次纯化包括以下步骤：

a)西番莲抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤制得抗氧化肽粗品溶液；

b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和磁化水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液；

c)抗氧化肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗氧化肽精纯溶液；

d)抗氧化肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗氧化肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到西番莲抗氧化肽成品。

6.根据权利要求5所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述二次纯化步骤的磁化水中含有10～25ppm的乙酸。

7.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤b)的过程为：抗氧化肽粗品溶液装入到半透膜，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.2～3.5；然后将含抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝4.6～5.0。

8.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤c)的反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min。。

9.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤d)的通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐。

10.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤d)的干燥采用减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50～-10℃保持2～4h，使真空度恒定在0.01～1.00Mbar，升温干燥12～36h。