[发明专利]用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法

权利要求书

1.RT-LAMP检测引物，其特征在于，所述引物的序列如下：

外引物ANRSV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物ANRSV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物ANRSV-FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物ANRSV-BIP：序列如SEQ ID NO：4所示。

2.如权利要求1所述RT-LAMP检测引物在制备槟榔坏死环斑病毒检测试剂中的应用。

3.一种槟榔坏死环斑病毒的RT-LAMP检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述RT-LAMP检测引物。

4.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂，其特征在于，还包括dNTP、缓冲液、Bst DNA聚合酶、核酸染料、MgSO₄及水。

5.根据权利要求4所述的RT-LAMP检测试剂，其特征在于，还包括甜菜碱、AMV逆转录酶。

6.一种槟榔坏死环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于，采用权利要求3至5中任一项所述RT-LAMP检测引物对槟榔坏死环斑病毒的RNA进行扩增。

7.根据权利要求6所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，模板是RNA时，所述RT-LAMP检测方法的反应体系如下：

dNTP 1~3mM；

10×缓冲液 2.5μL；

甜菜碱 0~1.5M；

MgSO₄ 0~10mM；

ANRSV-FIP 3~7μmol；

ANRSV-BIP 3~7μmol；

ANRSV-F3 20~60μmol；

ANRSV-B3 20~60μmol；

AMV逆转录酶 1~8U；

Bst DNA聚合酶 2~20U；

模板RNA 1pg；

用水补足25μL；

其中，甜菜碱和MgSO₄均不为0；

模板是cDNA或质粒时，所述RT-LAMP检测方法的反应体系如下：

dNTP 1~3mM；

10×缓冲液 2.5μL；

甜菜碱 0~1.5M；

MgSO₄ 0~10mM；

ANRSV-FIP 3~7μmol；

ANRSV-BIP 3~7μmol；

ANRSV-F3 20~60μmol；

ANRSV-B3 20~60μmol；

Bst DNA聚合酶 2~20U；

模板cDNA或质粒 1pg；

用水补足25μL；

其中，甜菜碱和MgSO₄均不为0。

8.根据权利要求7所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，还包括向扩增得到的反应产物中加入核酸染料，所述核酸染料在反应产物中的加入量为0.01μL/μL。

9.根据权利要求7所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应温度为57~65℃，反应时间为30~60min；

还包括向扩增得到的反应产物中加入核酸染料，所述核酸染料为10000×SYBR GreenI。

10.根据权利要求9所述的RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述RT-LAMP检测方法的判断方法为：

反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，待测样品中不含槟榔坏死环斑病毒；

反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有槟榔坏死环斑病毒。