[发明专利]用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法

说明书

本发明涉及生物技术及微生物检测技术领域，特别涉及用于检测ANRSV的RT‑LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。该检测引物的序列如下：外引物ANRSV‑F3、外引物ANRSV‑B3、内引物ANRSV‑FIP、内引物ANRSV‑BIP。本发明的槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)RT‑LAMP检测体系和检测方法针对病毒基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适用于基础实验室和田间检测。

技术领域

本发明涉及生物技术及微生物检测技术领域，特别涉及用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。

背景技术

槟榔作为我国重要的南药资源之一，是热带高效经济作物。目前，槟榔已经成为中国南方许多省份重要的支柱产业，保证并提高槟榔产量和品质具有重要意义。然而，近年来由于槟榔坏死环斑病毒(ANRSV)在南方各省的频发和蔓延，造成槟榔产量和品质下降，并有继续恶化的态势，造成严重的经济损失。因此，对于槟榔坏死环斑病毒的鉴定及预防具有相当重要的意义。

ANRSV在各地广泛分布，影响严重，具有危害性强、传播扩散快和难以治愈的特点。植株受到病毒危害后，病毒在寄主细胞内寄生并增殖，破坏干扰植株的正常生理机能，严重影响植株的生长，造成果实品质及产量的下降甚至绝收。病毒的早期准确检测和诊断以及迅速采取行动是控制植物病毒性疾病的关键。

ANRSV是马铃薯Y病毒科成员，基因组全长约10kb，共有HC-Pro1、HC-Pro2、P3、7K、CI、9K、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb及CP十个蛋白，该病毒侵染植物后症状为植株叶片黄化环斑及坏死。目前对植物病毒的检测，多采用传统生物学方法、血清学方法以及分子生物学方法。然而，传统方法耗时长，灵敏度不高，特异性差；血清学方法费用昂贵，操作步骤多，耗时较长，且样品中可能存在与抗体发生非特异性反应的杂质，易出现假阳性结果，因此只适合于初筛；而分子生物学方法由于其特异性强、灵敏度高，是现今应用最多的处于研究前沿的方法。为了适应产业发展需求，有必要开发一种能够更加快速、准确地对该病毒进行分子生物学检测的方法。

环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isotherm alamplificationof DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63)。而逆转录-环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度是普通RT-PCR的10-100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录与LAMP扩增在同一试管中同时完成。与常规PCR相比，RT-LAMP无需模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。可用于准确鉴定田间植株病害，及时监控发病情况，符合产业需求。目前，还未有针对ANRSV的RT-LAMP检测产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于检测ANRSV的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和检测方法。该检测引物假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了RT-LAMP检测引物，引物的序列如下：

外引物ANRSV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物ANRSV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；